木犀草素通過PI3K-Akt途徑調節(jié)巨噬細胞表型轉化抑制凋亡的機制研究.pdf

1、目的:動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)發(fā)病率和死亡率居各種疾病前列，嚴重地威脅著人類的健康和生命，探討其發(fā)病機制對于AS的防治具有重要的臨床意義和必要性。巨噬細胞作為形成AS中的重要因素，是目前預防和治療AS的重要靶點。探究有效的方法使得具有促炎作用的M1型巨噬細胞轉化為具有抗炎作用的M2型巨噬細胞，成為了預防和治療AS的重要研究方向。木犀草素(Luteolin，Lut)可通過PI3K/Akt通道發(fā)揮心肌保護作用，近

2、期研究發(fā)現(xiàn)Lut具有很強的抗AS作用。因此，本研究以小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，通過血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)誘導巨噬細胞凋亡，以PI3K/Akt通路抑制劑LY294002為對照，探討Lut對巨噬細胞表型的影響及其對巨噬細胞凋亡的作用，觀察Lut對PI3K/Akt通道的作用及其與巨噬細胞表型轉化、凋亡之間的關系，為Lut預防和治療動脈粥樣硬化性疾病提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:研究對象為健康雌性成年C57

3、BL/6J小鼠，體重20-25g，8周齡，清潔級。1.小鼠腹腔巨噬細胞原代細胞培養(yǎng)及鑒定:對小鼠腹腔巨噬細胞進行原代細胞培養(yǎng)，通過細胞形態(tài)學觀察及CD68免疫熒光鑒定巨噬細胞表面特征性標征判斷巨噬細胞原代培養(yǎng)情況。選用濃度分別為6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的Lut作用于巨噬細胞，通過CCK8法和乳酸脫氫酶檢測(lactate dehydrogenase LDH)明確Lut對小鼠腹腔巨噬細胞活力和

4、毒性的影響，觀察Lut的最佳作用濃度。2.觀察Lut對AngⅡ誘導的巨噬細胞凋亡及表型轉化的影響:實驗分組包括空白對照組、AngⅡ組(AngⅡ1μM預處理12小時)、AngⅡ+Lut組(Lut預處理12小時后AngⅡμM12小時)、AngⅡ+LY(LY294002)組(LY50μM預處理1小時后AngⅡ1μ M12小時)、AngⅡ+Lut+LY組(LY預處理1小時、Lut預處理12小時后AngⅡ1μM12小時)。觀察指標包括:(1)巨噬

5、細胞凋亡情況:采用Annexin V/PI檢測細胞凋亡比率，Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3。(2)巨噬細胞表型轉化情況:采用流式細胞儀和ELISA法檢測巨噬細胞表型分子標記物。3.Lut對Akt蛋白的作用特點(包括劑量及時間特點):實驗分組包括空白對照組、AngⅡ組(AngⅡ1μ M預處理12小時)、AngⅡ+LY(LY294002)組(LY50μM

6、預處理1小時后AngⅡ1μ M12小時)、AngⅡ+Lut不同時間干預組(以Lut25μM預處理3小時、9小時、12小時后AngⅡ1μM12小時)、AngⅡ+Lut不同劑量干預組(Lut6.25μM、12.5μM、25μM預處理12小時后AngⅡ1μM12小時)，利用Western blot檢測Akt、 p-Akt308、p-Akt473蛋白表達水平。采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計分析軟件分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準誤

7、表示(mean±S.E.M.)，兩兩比較采用q檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或兩因素方差分析(one-way ANOVA or two-way ANOVA)，按α=0.05的檢驗水準，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1.巨噬細胞原代培養(yǎng)結果:倒置顯微鏡下可見原代培養(yǎng)的巨噬細胞生長良好，激光共聚焦顯微鏡觀察可見成熟的巨噬細胞表面活性標記物CD68的陽性率大于99％，提示巨噬細胞原代培養(yǎng)成功，可用于實驗。2.CCK-8法

8、及LDH檢測不同藥物濃度Lut的毒性試驗:與對照組(Lut0μM)相比，從6.25μM到25μM濃度的Lut作用12h對細胞活力均無明顯影響，而從50μM濃度Lut處理組細胞活力明顯下降(P＜0.001);與對照組比較，Lut50μM濃度組LDH含量明顯增加(P＜0.05)。故選用25μM濃度的Lut對巨噬細胞進行干預。3.巨噬細胞凋亡情況: Annexin V/PI檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預處理組及LY預處理組均減少AngⅡ刺

9、激引起的巨噬細胞凋亡比率(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，Lut+LY組的效果未見增強(P＞0.05)。Westernbolt檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預處理組及LY預處理組Bcl-2和caspase-3蛋白水平顯著上調(P＜0.001)，Bax和cleaved caspase-3蛋白水平顯著下調(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，L

10、ut+LY組的效果未見增強(P＞0.05)。4.巨噬細胞表型轉化情況:ELISA檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預處理組及LY預處理組M1巨噬細胞分子標志(IL-6，TNF-α，iNOS，CD16/32)表達顯著減少(P＜0.001)，M2巨噬細胞分子標志(Dectin-1，IL-10，Arg-1，CD206)表達顯著增加(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，Lut+LY組的效果未見增強(P

11、＞0.05)。流式細胞儀檢測提示與AngⅡ組相比，Lut預處理組及LY預處理組M1型巨噬細胞(CD16/32細胞)顯著減少(P＜0.001)，M2型巨噬細胞(CD206細胞)顯著增多(P＜0.001)，且Lut組效果顯著強于LY組(P＜0.01);但與Lut組比較，Lut+LY組的效果未見增強(P＞0.05)。5.Lut對Akt蛋白的作用特點:Western Blot檢測提示，與AngⅡ組相比，LY組顯著抑制p-Akt(308)和p-A

12、kt(473)表達(P＜0.001)。Lut25μM預處理3小時組、9小時組、12小時組對p-Akt(308)和p-Akt(473)水平的抑制較AngⅡ組、LY組均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且抑制效應隨著時間延長逐漸增強，不同時間組對p-Akt(473)水平的抑制均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但Lut3小時組、9小時組對p-Akt(308)的抑制無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，Lut12小時組對p-Akt(308)的抑制顯著強于3小

13、時組、9小時組(P＜0.05)。Lut6.25μ M、12.5μM、25μ M預處理組對p-Akt(308)和p-Akt(473)水平的抑制較AngⅡ組、LY組均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且抑制效應隨著劑量增加逐漸增強，不同劑量組對p-Akt(473)水平的抑制均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但Lut6.25μ M、12.5μ M組對p-Akt(308)的抑制無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，Lut25μ M組對p-Akt(308)的抑