rhVEGF165通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)途徑抑制氧糖剝奪誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　 隨著人口逐漸老齡化,缺血性腦血管病的發(fā)病率逐年增高,目前已成為威脅人類生命的最主要疾病之一,其中腦梗死約占全部腦卒中的80％,腦梗死治療的關(guān)鍵是減輕缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡,已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF有減輕腦缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡的作用但其抗凋亡作用的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)研究人重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhVEGF165)通過調(diào)節(jié)P13K/Akt信號(hào)通路對(duì)氧糖剝奪(OGD,oxygen glucose deprivati

2、on)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)凋亡的影響,明確VEGF是否通過上調(diào)P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的p-Akt的表達(dá),減少cleaved caspase-3的表達(dá)來抑制缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,探討VEGF對(duì)缺血缺氧神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 用含10％胎牛血清和HEPES液(終濃度10mmol/L)改良的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞,每2-3天換液,取傳代后3天

3、的SH-SY5Y細(xì)胞,分為5組,A組(正常對(duì)照組);B組(OGD組):細(xì)胞缺血缺氧4小時(shí),恢復(fù)氧和血清供給24小時(shí);C組(VEGF干預(yù)組):細(xì)胞在氧糖剝奪(同B組條件)前30分鐘加入rhVEGFl65(濃度為100ng/mL);D組(LY294002干預(yù)組):細(xì)胞在氧糖剝奪(同B組條件)前30分鐘加入LY294002(濃度為50umol/L);E組(VEGF+LY294002雙干預(yù)組):細(xì)胞在氧糖剝奪(同B組條件)前30分鐘同時(shí)加入LY

4、294002(濃度為50umol/L)及VEGF(濃度為100ng/mL)。采用ArmexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,應(yīng)用免疫熒光染色和Western-Blotting法檢測(cè)p-Akt和cleaved caspasc-3的蛋白表達(dá)水平,觀察rhVEGF165對(duì)氧糖剝奪的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)P13K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中p-Akt、cleaved easpase-3表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)

5、果：
　　 一、SH-SY5Y細(xì)胞凋亡結(jié)果。
　　 氧糖剝奪后,B、C、D、E組細(xì)胞凋亡率均較A組(正常對(duì)照組)顯著增高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)細(xì)胞凋亡率較B組(OGD組)顯著減少,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)細(xì)胞凋亡率較B組(OGD組)顯著增高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);E組(VEGF+LY294002雙干預(yù)組)細(xì)胞凋亡率較C組(VEGF干預(yù)

6、組)增高,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 二、免疫熒光結(jié)果。
　　 實(shí)驗(yàn)各組均見p-Akt的表達(dá),均以胞漿表達(dá)為主,偶見胞核表達(dá),比較各組SH-SY5Y細(xì)胞熒光強(qiáng)度B組(OGD組)高于A組(正常對(duì)照組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)熒光強(qiáng)度高于B組(OGD組)(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)熒光強(qiáng)度明顯低于B組(OGD組)(p＜0.05);E組(VEGF+LY2940

7、02雙干預(yù)組)熒光強(qiáng)度顯著低于C組(VEGF干預(yù)組)(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)各組均見cleaved caLspase-3的表達(dá),均以胞漿表達(dá)為主,比較各組SH-SY5Y細(xì)胞熒光強(qiáng)度B組(OGD組)顯著高于A組(正常對(duì)照組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)熒光強(qiáng)度明顯低于B組(OGD組)(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)熒光強(qiáng)度明顯高于B組(OGD組)(p＜0.05);E組(VEGF+LY294002

8、雙干預(yù)組)熒光強(qiáng)度顯著高于C組(VEGF干預(yù)組)(p＜0.05)。
　　 三、蛋白免疫印跡結(jié)果。
　　 實(shí)驗(yàn)各組均見p-Akt的蛋白表達(dá),B組(OGD組)p-Akt蛋白表達(dá)水平高于A組(正常對(duì)照組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)p-Akt蛋白表達(dá)水平高于B組(OGD組),(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)p-Akt蛋白表達(dá)水平低于B組(OGD組),(p＜0.05);E組(VEGF

9、+LY294002雙干預(yù)組)p-Akt蛋白表達(dá)水平低于C組(VEGF干預(yù)組),(p＜0.05)。實(shí)驗(yàn)各組均見cleaved caspase-3的表達(dá),B組(OGD組)cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯高于A組(正常對(duì)照組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);C組(VEGF干預(yù)組)cleaved caLspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯低于B組(OGD組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);D組(LY294002干預(yù)組)c

10、leaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯高于B組(OGD組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);E組(VEGF+LY294002雙干預(yù)組)cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)水平明于高于C組(VEGF干預(yù)組),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 VEGF可減少氧糖剝奪后SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡,增加p-Akt的表達(dá),減少cleaved caspase-3的表達(dá),而LY294002(P