胸腺肽α-,1-經(jīng)PI3K-Akt信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的凋亡.pdf

1、目的： 1．體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)； 2．了解胸腺肽(T α <,1>)和維生素C(Vc)對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞凋亡的影響并進一步分析可能的機制； 3．觀察高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞磷酸化Akt表達量的改變及T α <,1>和Vc對其的影響； 4．觀察磷酸肌醇3激酶(P13K)抑制劑LY294002預(yù)處理后，T α <,1>和Vc對內(nèi)皮細胞凋亡及磷酸化Akt表達量的影響。 方法： 1

2、．引進已經(jīng)建立的臍靜脈內(nèi)皮細胞系ECV-304參照文獻報道進行體外培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光法進行細胞鑒定； 2．不同糖濃度(5.0mM和30mM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC 24 h和48 h，用Caspase-GloR3/7試劑盒測定細胞凋亡的情況； 3．T α <,1>和Vc作用于高糖(HG)環(huán)境的內(nèi)皮細胞24 h和48 h后，用Caspase-GloR3/7試劑盒測定細胞凋亡，并且比較T α <,1>和Vc對內(nèi)皮

3、細胞凋亡的影響； 4．LY294002預(yù)處理后，用Caspase-GloR3/7試劑盒測定T α <,1>和Vc對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞凋亡的影響； 5．不同糖濃度(5.0mM和30mM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC 24 h，用Western BloWing方法測定磷酸化Akt的表達量； 6．T α <,1>和Vc分別作用于高糖環(huán)境的內(nèi)皮細胞24 h后，用Western Blotting方法測定磷酸化Akt表達量的改變，

4、并且比較T α <,1>和Vc對內(nèi)皮細胞磷酸化Akt表達量的影響； 7．LY294002預(yù)處理后，用Western Blotting方法測定T α <,1>和Vc對高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞磷酸化Akt表達量的影響。 結(jié)果： 1．經(jīng)相差顯微鏡觀察及Ⅷ因子染色證實培養(yǎng)的是內(nèi)皮細胞(EC)，胎盤藍染色顯示95﹪以上的內(nèi)皮細胞存活良好； 2．培養(yǎng)24 h和48 h后，高糖組(30mM)和對照組(5mM)相比caspas

5、e-3和-7的活性分別增加了1.668倍(p<0.05)和1.676倍(p<0.05)； 3．將T α <,1>(96μM)或Vc(1μM)加入高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h或48h后，和HG組相比，caspase-3和-7的活性顯著減弱了(p<0.05)； 4．HG+Tα<,1>+LY294002組以及HG+Vc+LY294002組caspase-3和-7的活性和HG組相比結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)； 5．培養(yǎng)2

6、4h后，HG+Tα<,1>組Caspase-3和-7的活性比正常對照組下降了0.813倍，而HG+Vc組Caspase-3和-7的活性比正常對照組增加了1.216倍。并且HG+Tα<,1>組和HG+Vc組Caspase-3和-7的活性有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。培養(yǎng)48 h后，HG+Tα<,1>組和HG+Vc組Caspase-3和-7的活性無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)； 6．Tα<,1>的濃度與內(nèi)皮細胞磷酸化Akt的表達量之間

7、有劑量依賴型關(guān)系； 7．高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細胞24 h后，和正常對照組相比，磷酸化Akt的表達量顯著減少了(p<0.05)。在高糖培養(yǎng)基中加入Tα<,1>或Vc后，和HG組相比，磷酸化Akt的表達量顯著增加了(p<0.05)； 8．HG+Tα<,1>+LY294002組以及HG+Vc+LY294002組和HG組相比，磷酸化Akt表達量無統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)； 9．培養(yǎng)24h后，HG+Tα<,1>組磷酸化Akt的表

8、達量比HG+Vc組增加了1.666倍(p<0.05)。 結(jié)論： 1．高糖可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡并使其磷酸化Akt的表達量下降； 2．T α <,1>和Vc可以逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡和磷酸化Akt表達量的下降； 3．PI3K抑制劑阻斷了T α <,1>和Vc對高糖環(huán)境內(nèi)皮細胞的保護作用； 4．T α <,1>和Vc可能通過PI3K/Akt/eNOS/NO信號通路逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡以及磷酸化