PGC-1α在高糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞損傷與凋亡中的作用機制.pdf

1、研究目的:
　　本研究旨在利用攜帶有PGC-1α的小片段干擾核糖核酸的腺病毒(adenovirus encoding a small hairpinRNA of PGC-1α，Ad-shPGC-1α)降調節(jié)PGC-1α的表達，探討PGC-1α與高糖環(huán)境誘導下人臍靜脈血管內皮細胞損傷與凋亡的關系,并就其可能作用機制做系列深入研究，以期更好的了解糖尿病血管病變的發(fā)病機制，為早期預防糖尿病血管病變提供理論依據。
　　研究方法:

2、r>　　1.細胞培養(yǎng)與處理:在無菌條件下，取通過剖宮產手術出生，健康產婦的足月新生兒的臍帶，收集臍帶內人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)并在適宜條件下培養(yǎng)傳代，取38代的細胞進行后續(xù)實驗。為建立恰當的糖尿病體外實驗條件，首先將培養(yǎng)的臍靜脈血管內皮細胞分為基礎條件細胞組（對照組）（M199加全培養(yǎng)基含5.5mmol/L葡萄糖、20％FBS、2％L-谷氨酰胺、1

3、00U/ml青鏈霉素雙抗）、甘露醇組(甘露醇25mmol/L)、11mmol/L葡萄糖處理組，15mmol/L葡萄糖處理組及25mmol/L葡萄糖處理組共五組細胞，分別孵育48小時;再選擇最佳葡萄糖濃度下孵育細胞12、24、48、72、96小時。用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測PGC-1α蛋白表達。
　　2.探究下調PGC-1α對人臍靜脈內皮細胞增殖及凋亡的影響。(1)用攜帶PGC-1α

4、的小片段干擾核糖核酸的腺病毒(Ad-shPGC-1α)轉染臍靜脈血管內皮細胞，從而下調PGC-1α，用攜帶無效片段的PGC-1α小片段干擾核糖核酸的腺病毒(control shRNA，Ad-Scr)轉染臍靜脈血管內皮細胞作為對照，轉染條件為感染復數(multiplicity of infection，MOI)分別為10、20、40，轉染24小時。轉染后分別用Western Blot及實時定量PCR(Quantitative Real-t

5、ime PCR，qPCR)檢測PGC-1α蛋白表達及mRNA水平。(2)Ad-shPGC-1α及Ad-Scr分別轉染基礎條件細胞組及高糖誘導組細胞，用CCK8法檢測各組實驗細胞增殖（實驗分組:對照組、高糖誘導組、Ad-Scr轉染基礎條件細胞組及轉染高糖誘導組、Ad-shPGC-1α轉染基礎條件細胞組及轉染高糖誘導組）;用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡，使用的試劑盒為FITC-AnnexinⅤ/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒。
　　3.探明

6、下調PGC-1α對線粒體內膜通透性及膜電位的影響。(1)用鈣黃綠色染色法(Calcein-AM)檢測線粒體內膜通透性:將Calcein-AM探針和CoCl2與實驗細胞置于37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育10min，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察實驗絀胞，并用全自動定量繪圖酶標儀分析熒光密度;(2)用JC-1染色法檢測線粒體膜電位:將實驗細胞與JC-1染料于37℃環(huán)境內孵育15min。用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察實驗細胞，并用ImageJ軟件分析其熒光強

7、度。線粒體膜去極化的程度用紅光與綠光的比值來衡量。（實驗分組:對照組、高糖誘導組、轉染Ad-shPGC-1α高糖誘導組、轉染Ad-Scr高糖誘導組）
　　4.進一步探明下調PGC-1α對線粒體膜通透性的影響。檢測高糖誘導的內皮細胞細胞色素C(Cytochrome c，Cyt c)釋放和半胱氨酸蛋白水解酶(Caspase)活性的改變。用Western Blot分別檢測了細胞線粒體及細胞質內的Cyt c蛋白表達，細胞質Caspase-

8、3及Caspase-9的蛋白表達（實驗分組:同3）。
　　研究結果:
　　1.在不同葡糖糖濃度下孵育48小時后的實驗細胞，甘露醇組與對照組細胞增殖相同，無顯著性差異(P＞0.05)。不同高糖濃度處理下的各組細胞增殖均有降低，與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，在15mmol/L葡萄糖處理組降低最明顯;實驗細胞在15mmol/L葡萄糖濃度下孵育12，24，48，72和96小時后，在24，48，72和96小時組細胞增殖均

9、有降低，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，在孵育48小時組細胞增殖降低最明顯。
　　2.下調PGC-1α對人臍靜脈內皮細胞增殖及凋亡的影響。
　　(1)臍靜脈血管內皮細胞被Ad-shPGC-1α轉染，結果顯示，不同感染復數(MOI)的各組實驗細胞，PGC-1α蛋白表達及mRNA水平均有降低，與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，在感染復數為20條件下，PGC-1α蛋白表達及mRNA水平降低最明顯;同時用Ad-S

10、cr轉染的臍靜脈血管內皮細胞，未發(fā)現PGC-1α的蛋白表達及mRNA水平改變，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。
　　(2)用CCK-8法檢測臍靜脈血管內皮細胞增殖，實驗結果顯示在未經高糖誘導的血管內皮細胞中，轉染Ad-shPGC-1α或Ad-Scr后，均未見細胞增殖的下降，與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05);而高糖誘導細胞組，細胞增殖明顯降低，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-shPGC-1α的高

11、糖誘導組，細胞增殖進一步降低，與高糖誘導組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-Scr的高糖誘導組，細胞增殖明顯降低，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與高糖誘導組比較細胞增殖無變化(P＞0.05)。
　　3.下調PGC-1α對線粒體膜通透性及膜電位的影響。
　　(1)首先用鈣黃綠色染色法(Calcein-AM)檢測線粒體膜通透性。實驗結果發(fā)現:單獨高糖誘導組的臍靜脈內皮細胞，線粒體膜損傷，通透性增加，與Cal

12、cein-AM探針及CoCl2共同孵育后，膜內綠色熒光被膜外的CoCl2淬滅，膜內綠色熒光減少，熒光密度下降，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-shPGC-1α高糖誘導細胞組線粒體膜損傷加重，膜內綠色熒光進一步減少，熒光密度進一步降低，與高糖誘導組比較有顯著性差異(P＜0.01);而在轉染Ad-Scr高糖誘導組，膜內綠色熒光減少，熒光密度下降，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與高糖誘導組比較無明顯變化(P＞0

13、.05)。
　　(2)用JC-1染色法檢測線粒體膜電位。用JC-1線粒體熒光探針孵育實驗細胞，實驗結果發(fā)現，高糖誘導組線粒體基質內紅色熒光降低，同時綠色熒光增加，紅綠熒光的比值降低，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-shPGC-1α高糖誘導組，紅色熒光進一步減少，綠色熒光增加，紅綠熒光比值進一步降低，與高糖誘導組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-Scr高糖誘導組，紅綠熒光比值降低，與對照組比較有顯著性差

14、異(P＜0.01)，與高糖誘導組比較無明顯變化(P＞0.05)。
　　4.進一步探明下調PGC-1α對線粒體膜通透性的影響，檢測高糖誘導的臍靜脈內皮細胞細胞色素c釋放和半胱氨酸蛋白水解酶Caspase活性的改變。Western Blot結果顯示，在高糖誘導細胞組，細胞質內的細胞色素c蛋白表達增加，與此同時，線粒體內的細胞色素c明顯減少，細胞質與線粒體細胞色素c蛋白表達比值升高，與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-

15、shPGC-1α高糖誘導組，細胞質內細胞色素c蛋白表達進一步增加，線粒體內細胞色素c蛋白表達進一步減少，細胞質與線粒體細胞色素c蛋白表達比值進一步升高,與高糖誘導組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。在高糖誘導組細胞Caspase-3及Caspase-9蛋白表達都明顯增加，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01);轉染Ad-shPGC-1α的高糖誘導組，Caspase-3及Caspase-9蛋白表達增加更加明顯，與高糖誘導組比較有顯著性

16、差異(P＜0.01)。在轉染Ad-Scr高糖誘導組，細胞色素c及Caspase蛋白表達情況，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，與高糖誘導組比較無明顯變化(P＞0.05)。
　　研究結論:
　　1.在人臍靜脈血管內皮細胞中，PGC-1α的表達與高糖環(huán)境下細胞增殖相關;高糖誘導下的人臍靜脈血管內皮細胞增殖降低，同時PGC-1α表達降低。
　　2.下調PGC-1α會進一步降低高糖誘導下的人臍靜脈血管內皮細胞增殖，加重

17、高糖誘導下的血管內皮細胞的凋亡;但是對正常環(huán)境下的臍靜脈血管內皮細胞增殖與凋亡無影響;
　　3.下調PGC-1α加重高糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞的線粒體膜損傷，膜通透性增加，線粒體膜電位去極化程度降低。
　　4.下調PGC-1α增加高糖誘導的人臍靜脈血管內皮細胞細胞色素c釋放和半胱氨蛋白水解酶活性，進一步闡明下調PGC-1α加重線粒體膜通透性的改變。
　　5.下調PGC-1α導致的人臍靜脈血管內皮細胞凋亡增加與Bcl