Ad-HGF對高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用機制研究.pdf

1、目的：通過體外建立高糖損傷原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell。HUVECs）模型，探究攜帶肝細胞生長因子基因的重組腺病毒（Ad-HGF）對高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷的保護作用及其分子機制，為基因藥物Ad-HGF防治糖尿病血管病變提供理論依據(jù)。
　　方法：⑴HUVECs分離、培養(yǎng)、鑒定：采用Ⅱ型膠原蛋白酶消化法分離原代HUVECs，ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)，CD31熒光抗體染色流式

2、細胞儀鑒定；⑵將細胞分為低濃度葡萄糖組(5.5mmol/L，LG組)和高濃度葡萄糖糖組（35mmol/L，HG組），CCK8法分別檢測高糖處理24h、72h和120h對HUVECs存活率影響，確定高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷時間；⑶用不同感染復(fù)數(shù)(Multiplicityofy infection。MOI)的Ad-GFP感染HUVECs，確定最佳MOI值；⑷Ad-HGF感染HUVECs分別留取24h、48h、72h、96h和120h的培養(yǎng)上

3、清，ELISA法檢測培養(yǎng)上清中HGF濃度；⑸高糖處理HUVECs72h，感染腺病毒，感染48h后CCK8法分別檢測LG組、HG組、高糖并感染Ad-GFP組（HG+Ad-GFP組）、高糖并感染Ad-HGF組（HG+Ad-HGF組）細胞存活率。⑹Western Blot分別檢測各組凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2，鞘氨醇激酶1（Sphingosine Kinase1。SPHK1），沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent mating type inf

4、ormation regulation2 homolog1。SIRT1），內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial Nitric Oxide Synthase。eNOS）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix Metalloproteinases2。MMP2）蛋白表達。
　　結(jié)果：①細胞培養(yǎng)至24h可觀察到短梭形貼壁細胞，培養(yǎng)72小時即可傳代培養(yǎng)，細胞呈典型的“鋪路石”樣排列，狀態(tài)良好。流式細胞儀檢測CD31抗原陽性細胞99.64％；

5、②HG組72h和120h細胞存活率分別為86.9%和70.4%，HG組24h與LG組相比細胞存活率無差異，確定高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷時間為72h；③根據(jù)感染不同MOI值A(chǔ)d-GFP對感染效率和細胞存活率的影響，確定腺病毒感染HUVECs最佳MOI值為100。④Ad-HGF感染HUVECs后24h培養(yǎng)基HGF濃度即可達到（67.04±1.63）ng/mL,高于對照組(2.44±0.30) ng/mL（P＜0.01），48h、72h、96

6、h和120h培養(yǎng)上清中HGF濃度均高于對照組（P＜0.01）。⑤設(shè)LG組細胞存活率為1，HG+Ad-HGF組細胞存活率比HG組高16.53%（P＜0.05）。HG+Ad-GFP組與HG組細胞存活率無差異（P＞0.05）。6.與LG組相比HG組可上調(diào)Bax、MMP2蛋白表達，下調(diào)Bcl2、SIRT1、eNOS蛋白表達。與HG組相比HG+Ad-HGF組可上調(diào)Bcl2、SIRT1、eNOS蛋白表達、下調(diào)Bax、MMP2蛋白表達。與HG組相比感

7、染Ad-GFP不影響目的蛋白表達，各組SPHK1蛋白表達無差異。
　　結(jié)論：⑴高濃度葡萄糖可以使HUVECs存活率降低，該機制與Bax/Bcl2比值升高，細胞凋亡率增加有關(guān)。感染Ad-HGF可使Bax/Bcl2降低，HUVECs存活率升高。⑵高糖通過抑制HUVECs SIRT1-eNOS信號通路，減少NO合成。HGF可通過激活SIRT1-eNOS信號通路，增加NO合成，改善血管舒張功能。⑶高糖可誘導(dǎo) HUVECs MMP2蛋白表達