靈芝多糖肽對人臍靜脈內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用.pdf

1、目的：研究靈芝多糖肽(GLPP)對損傷HUVEC細胞的保護作用，并探討其可能的機制。
　　 方法：原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，CD31免疫熒光法鑒定細胞。選用不同濃度(2.4×10-5、4.8×10-5、9.5×10-5、1.9×10-4、3.8×10-4、7.6×10-4mol·L-1)的叔丁基氫過氧化物(t-BOOH)為氧化劑損傷細胞，采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測各組細胞的活性；在1.9×10

2、-4 mol·L-1t-BOOH造成的氧化損傷模型中，加入不同濃度GLPP(6.125、12.5、25、50、100 mg·L-1)，采用CCK-8法檢測各組細胞活性；收集不同濃度GLPP(6.125、25、100 mg·L-1)處理后的損傷細胞，采用Hoechst33258檢測凋亡率；電鏡檢測細胞及細胞器形態(tài)學(xué)改變；比色法檢測Caspase-3活性變化；激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microsco

3、pe，LSCM)檢測細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,△ψm)的變化；Western Blot檢測Bcl-2蛋白表達變化；以及熒光探針DCFH-DA裝載后，LSCM檢測熒光強度，以明確細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量的變化情況。
　　 結(jié)果：⑴體外培養(yǎng)的HUVECs，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光鑒定，為HUVECs。⑵CCK-8結(jié)果顯示，用不同

4、劑量t-BOOH(2.4×10-5、4.8×10-5、9.5×10-5、1.9×10-4、3.8×10-4、7.6×10-4mol·L-1)作用HUVEC細胞24h后，細胞活性隨藥物濃度的增加依次下降，除2.4×10-5mol·L-1t-BOOH組與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P＞0.05)，其它各組與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑶CCK-8結(jié)果顯示，正常對照組細胞的OD值為1.30±0.051，1.9×10-4

5、mol·L-1t-BOOH損傷組的OD值為0.57±0.060，GLPP(6.125、12.5、25、50、100 mg·L-1)可減輕叔丁基氫過氧化物對HUVECs的氧化損傷，OD值分別為0.66±0.063、0.74±0.080、0.85±0.060、0.91±0.057、1.07±0.087，各GLPP給藥組與1.9×10-4mol·L-1t-BOOH損傷組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。⑷Hoechst33258檢測正常對照

6、組細胞的凋亡率為(3.2±1.2)％，t-BOOH損傷組細胞凋亡率為(57.8±3.0)％，GLPP(6.125、25、100 mg·L-1)給藥組細胞凋亡率分另為(47.4±1.1)％、(33.8±3.9)％、(25.8±1.6)％(P＜0.05)。⑸電鏡可見GLPP(6.125、100 mg·L-1)給藥組減輕1.9×10-4mol·L-1t-BOOH引起的細胞器如線粒體的氧化損傷，減少細胞凋亡。⑹比色法顯示正常對照組細胞Caspa

7、se-3活性為0.03±0.005，t-BOOH損傷組Caspase-3活性為0.09±0.075，GLPP(6.125、25、100 mg·L-1)濃度藥物組Caspase-3的活性分別為0.07±0.069，0.05±0.087，0.04±0.041(P＜0.01)。⑺LCSM結(jié)果顯示正常對照組細胞平均熒光強度為122.64±10.03，1.9×10-4mol·L-1t-BOOH損傷組平均熒光強度為57.96±8.35，GLPP(6

8、.125、25、100 mg·L-1)處理的HUVEC細胞的Rh123平均熒光強度分別為75.54±9.78、91.3±8.16、106.44±9.00(P＜0.05)。⑻Western Blot結(jié)果顯示，1.9×10-4mol·L-1t-BOOH孵育HUVEC細胞24h后，與正常對照組相比，Bcl-2蛋白的表達明顯減少，GLPP(6.125、25、100 mg·L-1)能減輕t-BOOH氧化損傷引起的凋亡蛋白表達的減少。⑼DCFH-D

9、A結(jié)果表明：正常對照組細胞平均熒光強度為52.92±11.09，1.9×10-4mol·L-1t-BOOH可使HUVEC細胞內(nèi)ROS水平顯著增加，平均熒光強度為112.89±10.37，GLPP(6.125、25、100 mg·L-1)處理HUVEC細胞內(nèi)平均熒光強度分別為91.55±9.1、79.66±9.86、64.4±8.12，與t-BOOH損傷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：①GLPP對t-BOOH