砷對人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷及硒干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　 研究不同濃度砷對體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的損傷作用;不同濃度硒對體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞生長的影響;適宜濃度的硒對不同濃度砷造成的血管內(nèi)皮細胞損傷的拮抗作用。
　　 方法
　　 人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)置于37℃,5％CO2,飽和濕度條件下培養(yǎng)。細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗。實驗分組:加砷組、加硒組和加砷

2、加硒組。加硒組硒(Se)濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、2μmol/L。加砷組和加砷加硒組砷(As)濃度分別為0.05、0.1、0.5、1.5、3、6、12μmol/L,加砷加硒組硒濃度為0.1μmol/L,每組均設(shè)空白對照作為對照組。連續(xù)培養(yǎng)48h后收集細胞培養(yǎng)液與細胞待用。采用四唑鹽(Methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法測定細胞活性;瑞氏-吉姆薩染色(Wrigh-Giemastaining)

3、觀測細胞形態(tài),吖啶橙熒光染色(Acridine orang staining)測定細胞凋亡的情況。檢測培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-px)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。檢測培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及誘

4、導(dǎo)型一氧化氮合酶(Induciblenitric oxide synthase,iNOS)活性。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測培養(yǎng)液中細胞間粘附分子-1(Intercellular celladhesion molecule-1,ICAM-1)和血管細胞粘附分子-1(Vasular cell adhesionmolecule-1,VCAM-1)的表達情況。采用逆轉(zhuǎn)

5、錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription polymersade chain reaction,RT-PCR)測定eNOSmRNA、iNOSmRNA表達水平。多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用q檢驗。
　　 結(jié)果
　　 1砷對血管內(nèi)皮細胞損傷作用
　　 1.1細胞形態(tài)學(xué)觀察
　　 瑞氏-吉姆薩染色發(fā)現(xiàn)加砷組血管內(nèi)皮細胞的數(shù)量隨著濃度的增大而減少,內(nèi)皮細胞收縮變形,細胞間隙增大,隨著濃度的

6、升高,細胞膜損傷,細胞核固縮。出現(xiàn)“裸核”現(xiàn)象,甚至可見網(wǎng)狀的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。吖啶橙染色細胞核變形明顯,聚集在細胞邊緣,熒光碎片增多。
　　 1.2砷對細胞生長的影響
　　 加砷組與對照組相比,砷濃度為0.05μmol/L時,細胞生長正常(P＞0.05)。砷濃度為0.1μmol/L時明顯抑制細胞的生長(P＜0.01),抑制作用隨著培養(yǎng)液中砷濃度的增大而增強。
　　 1.3砷對培養(yǎng)液中SOD、GSH-Px活性和MDA含

7、量的影響
　　 砷濃度為0.05μmol/L時,SOD、GSH-pX活性和MDA含量均無顯著變化(P＞0.05),砷濃度為0.5μmol/L時,培養(yǎng)液中MDA含量明顯增加(P＜0.05)。隨著砷濃度的升高,SOD、GSH-pX活性下降,MDA含量增加(P＜0.01)。
　　 1.4砷對培養(yǎng)液中NOS活性及細胞NOSmRNA表達水平的影響
　　 砷濃度為0.05、0.1μmol/L時,對NOS活性及NOS mRNA

8、表達無影響,(P＞0.05),隨著砷濃度增大eNOS活性及eNOS mRNA表達水平逐漸減弱(P＜0.01),iNOS活性和iNOSmRNA表達水平則逐漸增強(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 1.5砷對培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1表達的影響
　　 砷濃度為0.05、0.1μmol/L時,對培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1表達無影響(P＞0.05);隨著砷濃度的增大,兩種CAM表達水平逐漸增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意

9、義(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2硒對血管內(nèi)皮細胞的影響
　　 通過研究硒對內(nèi)皮細胞形態(tài)、細胞活性、培養(yǎng)液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、內(nèi)皮細胞NOS活性和NOSmRNA表達、內(nèi)皮細胞的ICAM-1和VCAM-1表達的影響,0.1μmol/L硒對細胞生長無任何不良影響且有一定的積極作用,從而確定硒的干預(yù)劑量為0.1μmol/L。
　　 3硒對砷造成血管內(nèi)皮細胞損傷的干預(yù)作用
　　 3.

10、1硒對砷造成細胞形態(tài)改變的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細胞48 h后細胞染色觀察,砷濃度0.05、0.1μmol/L細胞形態(tài)正常;隨著砷濃度的增加,細胞形態(tài)逐漸不規(guī)則,細胞膜損傷加重,凋亡細胞增多。吖啶橙染色可見形熒光碎片增多。
　　 3.2不同濃度砷和適量硒對細胞活性的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細胞48 h后,MTT測定細胞活性,結(jié)果顯示,與同劑

11、量加砷組相比,在砷的濃度為0.1、0.5μmol/L時,細胞增殖率升高,(P＜0.05)。隨著砷濃度的增大,與加砷組比較,各組細胞增殖率均有所升高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)
　　 3.3不同濃度砷和適量硒對細胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細胞48 h后,與同劑量加砷組相比,培養(yǎng)液中SOD在砷濃度為0.05、0.5μmol/L,GSH-

12、px在砷濃度為0.05、0.1μmol/L時,活性均有所升高(P＜0.05)。培養(yǎng)液中MDA含量在砷濃度為0.05、0.1μmol/L時有所下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.4不同濃度砷和適量硒對細胞培養(yǎng)液中NOS活性和細胞NOSmRNA表達的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μmol/L硒培養(yǎng)細胞48 h后,與同劑量加砷組相比,砷濃度為0.05、0.1、0.5μmol/L時,eNOS活性升高(

13、P＜0.05),砷濃度為0.05、0.1μmol/L時,iNOS活性降低(P＜0.05)。RT-PCR測定結(jié)果顯示,砷濃度為0.05、0.5、1.5μmol/L時,加砷加硒組eNOS mRNA含量升高(P＜0.05),砷濃度為0.05、0.1、1.5μmol/L,時,加砷加硒組iNOS mRNA含量有所下降(P＜0.05)
　　 3.5不同濃度砷和適量硒對內(nèi)皮細胞粘附分子表達的影響
　　 培養(yǎng)液中加入不同濃度砷和0.1μ

14、mol/L硒培養(yǎng)細胞48 h后,與同劑量加砷組相比,砷濃度為0.05、0.1μmol/L時,加砷加硒組細胞培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1含量降低(P＜0.05),隨著砷濃度增大,細胞培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1雖有不同程度降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、砷可以使內(nèi)皮細胞形態(tài)發(fā)生改變,并且導(dǎo)致細胞的調(diào)亡;適量硒可拮抗砷對細胞的損傷。
　　 2、砷可使培養(yǎng)液中的SOD、GS

15、H-Px活性降低,MDA含量增高;適量硒可改善這種現(xiàn)象,使SOD、GSH-Px活性明顯升高,MDA含量下降。
　　 3、砷可抑制內(nèi)皮細胞eNOS mRNA的表達,使培養(yǎng)液中eNOS活性降低;刺激iNOS mRNA的表達,使培養(yǎng)液中iNOS活性增強;適量硒可以改善砷對細胞NOS mRNA的影響,使eNOS和iNOS活性趨于正常。
　　 4、砷可刺激內(nèi)皮細胞粘附分子的表達,使培養(yǎng)液中ICAM-1和VCAM-1的表達水平增高;