NO-1886對高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景和目的: 近期研究指出血管內皮功能障礙(Endothelial dysfunction， ED)是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)發(fā)生和加重的重要基礎或起始事件，也是糖尿病血管病變發(fā)生的主要原因，假性血友病因子(vonWillebrand factor， vWF)、內皮素-1(Endothelin-1，ET-1)是檢測 ED的兩個重要指標。內皮細胞功能障礙主要特征之一表現(xiàn)為內皮細胞異常凋亡。細胞凋亡(apop

2、tosis)，亦稱為程序化的細胞死亡(Programmed cell death，PCD)，是一種不同于細胞壞死的生理性或者病理性的死亡過程。研究證實，在高糖對血管內皮細胞損傷過程中細胞凋亡起著重要的作用，因此，防治高糖誘導的內皮細胞凋亡在預防糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展有著重要意義。2型糖尿病(diabetes mellitus type2，T2DM)血管內皮功能紊亂與蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB/Akt)活性

3、受到抑制有關。Akt是體內重要的凋亡抑制蛋白，介導了腫瘤、糖尿病等多種疾病的病理過程，通過Thr308和Ser473位點磷酸化使Akt激活，進而磷酸化底物調節(jié)細胞凋亡和細胞代謝。
　　實驗證明，NO-1886具有很強的活化脂蛋白脂酶的作用，它能夠提高動物脂肪、心肌和骨骼肌組織中 LPLmRNA的表達和LPL活性，可提高血漿 LPL活性30~40％，降低血糖、血漿三酰甘油，升高高密度脂蛋白膽固醇水平；促進脂質氧化，能抑制脂質蓄積，減

4、輕胰島素抵抗，降低血漿葡萄糖濃度，抑制糖尿病實驗動物動脈粥樣硬化病變。本研究通過體外培養(yǎng)高糖誘導的人臍靜脈內皮細胞這個平臺，從細胞和分子水平，觀察NO-1886對高糖誘導的內皮細胞功能障礙是否有保護作用，研究高糖環(huán)境下NO-1886對內皮細胞損傷的作用是否與內皮細胞凋亡有關，并探討NO-1886抗凋亡的分子機制。
　　方法: 體外培養(yǎng)，利用高濃度葡萄糖誘導人臍靜脈內皮細胞功能損傷。用普通光鏡和Hoechst33258熒光染色觀察H

5、UVECs細胞形態(tài)和核形態(tài)的變化；Annexin V和PI雙染的流式細胞術進行細胞凋亡定量；用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測細胞內Akt、ET-1、vWF mRNA的表達；細胞免疫熒光檢測細胞內ET-1、vWF蛋白水平的改變；用Western blotting免疫印跡實驗檢測Akt總蛋白表達及Akt-Thr308及Akt-Ser473的磷酸化水平。
　　結果: (1)與對照組細胞比較，用不同濃度高糖處理HUVECs細胞72小時

6、后，普通光學顯微鏡下觀察到，細胞數(shù)目減少，圓形細胞明顯增多，細胞間隙增寬，細胞邊界不清；Hoechst33258染色結果表明有細胞核濃縮、呈高亮度藍色熒光的凋亡細胞；流式細胞術檢測結果表明細胞凋亡率顯著增加；細胞 ET-1、vWF mRNA及蛋白表達上調；Akt磷酸化水平下降。(2)不同濃度的NO-1886對體外高糖環(huán)境下內皮細胞凋亡和Akt的活性及ET-1、vWF的表達有著不同的影響：低濃度(2，4，8μmol/L)NO-1886短時

7、間(6，12，24，48h)處理可抑制高糖誘導的內皮細胞凋亡，增加Akt的活性，顯著降低ET-1、vWF mRNA及蛋白表達；而高濃度(32mol/L) NO-1886及長時間(72h)處理則進一步降低Akt的活性，加重高糖的細胞毒性作用。(3)PI3K阻斷劑LY294002可抑制NO-1886的抗凋亡作用，減弱NO-1886對Akt的磷酸化。(4)NO-1886對Akt mRNA及其總蛋白表達的影響無統(tǒng)計學意義。
　　結論: