Celecoxib聯(lián)合Cisplatin通過PI3K-Akt途徑誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma)是兒童和青少年最常見的起源于間充質(zhì)細(xì)胞的惡性骨腫瘤。隨著骨肉瘤治療手段的進(jìn)展，如擴(kuò)大切除術(shù)、放療和新輔助化療，其5年生存率已經(jīng)增加到50～60％。以鉑類為基礎(chǔ)的藥物，例如順鉑，是骨肉瘤化療常用的有效的藥物。 環(huán)氧化酶(cyclooxygenase，COX)是催化花生四烯酸合成前列腺素(PG)的限速酶。研究表明，COX至少有兩種同工酶，結(jié)構(gòu)型COX即COX-1基因定位于染色體9q32～33.3，在

2、各種組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)；誘導(dǎo)型COX即COX-2基因定位于染色體lq25.2～25.3，是一種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)基因，在正常組織中一般沒有明顯表達(dá)；COX-3是COX-1的一種剪接變體，在哺乳動物的大腦皮層有豐富的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)COX-2高表達(dá)存在潛在的致瘤性，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其生物學(xué)行為密切相關(guān)。非甾體類抗炎藥(NSAIDs)是COX的抑制劑，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)化療藥物的細(xì)胞毒作用。選擇性COX-2抑制劑Celecoxib是近年

3、來開發(fā)的新型非甾體類抗炎藥，其特點(diǎn)是選擇性作用于COX-2，對COX-1的活性幾乎沒有抑制作用。盡管Celecoxib精確的機(jī)制尚不明確，然而它的抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡是眾所周知的，這在結(jié)直腸腫瘤和家族性腺瘤性息肉病中已經(jīng)得到了證實(shí)。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究Celecoxib和/或Cisplatin誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，并探討其機(jī)制。我們研究發(fā)現(xiàn)，MG-63細(xì)胞經(jīng)過Celecoxib(50，100μmol/L)和/或

4、Cisplatin(10μg/ml)處理48h后，細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)證實(shí)Celecoxib和Cisplatin均能夠抑制MG-63細(xì)胞的增殖，并且Celecoxib呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。Celecoxib聯(lián)合Cisplatin對MG-63細(xì)胞的生長具有協(xié)同抑制作用。倒置顯微鏡觀察藥物干預(yù)后的MG-63細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積變小、皺縮、變圓、脫落。電鏡檢測發(fā)現(xiàn)藥物作用后細(xì)胞變圓收縮，染色質(zhì)凝集成半月形附于核膜，核裂解并可見凋亡小體。在Ce

5、lecoxib(100μmol/L)和Cisplatin(10μg/ml)聯(lián)合作用于MG-63 48h后可見到特征性的梯形DNAladder條帶。利用流式細(xì)胞儀分析藥物作用后的MG-63細(xì)胞，檢測到G1期阻滯和凋亡，并且Celecoxib(100μmol/L)和Cisplatin(10μg/ml)聯(lián)合的凋亡率明顯的高于其他的實(shí)驗(yàn)組，這與DNA ladder的結(jié)果吻合。 Celecoxib為選擇性的COX-2抑制劑，其誘導(dǎo)凋亡可分

6、為COX-2和非COX-2途徑。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們通過RT-PCR和Western blot證實(shí)Celecoxib聯(lián)合Cisplatin作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63并沒有發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)的下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，Celecoxib聯(lián)合Cisplatin明顯的降低了PI3K/Akt、survivin、bcl-2的表達(dá)，更為重要的是檢測到了procaspase-9，procaspase-3和PARP的裂解片段。因此，Celecoxib通過非COX

7、-2途徑誘導(dǎo)MG-63的凋亡，可能與PI3K/Akt、survivin、bcl-2相關(guān)。為了證實(shí)PI3K/Akt途徑在西樂葆抗腫瘤中的作用，我們使用特異性的PI3K抑制劑wortmannin(1μmol/L)作用于MG-63細(xì)胞48h，檢測到pAkt(Thr308)，bcl-2，survivin表達(dá)的下調(diào)，這證實(shí)西樂葆誘導(dǎo)腫瘤凋亡作用是通過PI3K/Akt途徑。因此，PI3K/Akt途徑在survivin、bcl-2表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作