順鉑通過miR-16下BDNF表達(dá)抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長的研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童時期最常見的惡性腫瘤，平均發(fā)病年齡為17個月。腫瘤起源于神經(jīng)嵴組織，發(fā)生在人體深部腎上腺髓質(zhì)和椎旁神經(jīng)節(jié)位置。由于沒有特定的臨床表現(xiàn)，大約50％到60％的患者被確診時已到晚期。經(jīng)過多學(xué)科治療，甚至引入劑量密集化療方案，但高風(fēng)險神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后仍然無明顯改善，5年生存率小于50％。
　　MicroRNAs(miRNAs)是非編碼小RNA，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。通過與靶mRNA不完全結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制或靶基因的

2、不穩(wěn)定。miRNA可作為腫瘤抑制基因和癌基因。研究表明，miR-106a在胃癌組織中過表達(dá)，具有致瘤作用。miR-16作為腫瘤抑制基因，通過調(diào)節(jié)BMI1，在套細(xì)胞淋巴瘤SP細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致裸鼠淋巴瘤移植瘤縮小。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的成員，通過與其特異性受體TrkB結(jié)合，在神經(jīng)元存活、分化、和軸突延伸過程中起著非常關(guān)鍵的作用。研究表明，BDNF-TrkB信號通路不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長，而且還影

3、響許多腫瘤，如肺癌，膀胱癌，胰腺癌等的發(fā)生、侵襲和預(yù)后。最近的一項研究表明，BDNF能增強(qiáng)移行細(xì)胞癌的增殖和存活。BDNF高表達(dá)與腫瘤（包括胰腺癌和乳腺癌）惡化有關(guān)。
　　順鉑是治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤的有效藥物，它可以抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長，然而有關(guān)順鉑抗腫瘤作用的分子機(jī)制還不明確。在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-21的表達(dá)在順鉑治療后明顯下降，而miR-21又可以下調(diào)MSH2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，這一結(jié)果提示我們探討順鉑作用后引起的

4、miRNA表達(dá)變化，并檢測下游分子的改變，能夠進(jìn)一步明確順鉑抗癌機(jī)制，也為新型抗癌藥物的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)?；趍iR-16和BDNF目前公認(rèn)的作用，以及二者之間可預(yù)測的相關(guān)性，在本研究中，我們選擇miR-16和BDNF作為研究對象，來探討順鉑抗腫瘤作用的分子機(jī)制。
　　為了明確順鉑、miR-16和BDNF在神經(jīng)母細(xì)胞瘤內(nèi)的表達(dá)情況以及三者之間的相關(guān)性，本研究設(shè)計三部分實驗來進(jìn)行:（一）研究順鉑抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長及相關(guān)分子m

5、iR-16、BDNF的表達(dá)變化;（二）研究miR-16抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長的機(jī)制;（三）研究順鉑對SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤的抑制及影響機(jī)制。
　　第一部分，順鉑抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長及相關(guān)分子miR-16、BDNF表達(dá)變化的研究
　　目的:
　　研究順鉑對SH-SY5Y細(xì)胞生長的影響，闡明順鉑作用后miR-16和BDNF兩種分子在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
　　方法:
　　取生長狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)

6、胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜后，每孔加入不同劑量的順鉑，使培養(yǎng)基中的順鉑濃度分別為0μg/ml，1.5μg/ml;3μg/ml;4.5μg/ml;6μg/ml;12μg/ml。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，分別進(jìn)行如下實驗:放在倒置相差顯微鏡下，觀察細(xì)胞的狀態(tài)和數(shù)量;向培養(yǎng)孔內(nèi)加入MTT溶液，4h后棄掉培養(yǎng)基，每孔加100μlDMSO溶解結(jié)晶，570nm波長測量吸光度值，并計算細(xì)胞生長抑制率:使用AnnexinV-FITC和PI對收集的細(xì)胞進(jìn)行雙染

7、，通過流式細(xì)胞儀檢測，分析不同濃度下各組的細(xì)胞凋亡率;收集順鉑作用后的SH-SY5Y細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并通過實時定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)水平;提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用BDNF抗體進(jìn)行雜交，再通過酶標(biāo)的二抗使底物顯色，拍照后觀察BDNF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　隨著順鉑濃度的增加，視野下可見的活細(xì)胞密度逐漸減少，而漂浮的死細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞密度降低;MTT結(jié)果顯示，當(dāng)順

8、鉑濃度達(dá)到6μg/ml時，細(xì)胞生長抑制率已超過一半，并且抑制率與順鉑的濃度呈正相關(guān);通過流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示，0μg/ml組細(xì)胞凋亡率明顯低于順鉑作用后的各組，并且隨著順鉑濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐步升高;實時定量PCR結(jié)果表明，順鉑作用后，SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)miR-16表達(dá)顯著升高;Westernblotting測定細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)，在順鉑濃度達(dá)到3μg/ml后，細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)水平顯著降低。
　　結(jié)論:
　　

9、順鉑可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長，引起細(xì)胞凋亡增加;同時，順鉑還可以使細(xì)胞內(nèi)miR-16表達(dá)升高;相反的，在順鉑作用后細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)降低。
　　第二部分，miR-16抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長機(jī)制的研究
　　目的:
　　明確miR-16對SH-SY5Y細(xì)胞生長的影響，預(yù)測miR-16與BDNF的相關(guān)性，并證明miR-16對BDNF表達(dá)的影響。
　　方法:
　　化學(xué)合成miR-16的雙鏈寡核苷酸鏈，

10、當(dāng)培養(yǎng)板內(nèi)的SH-SY5Y細(xì)胞密度達(dá)到60％左右時，通過脂質(zhì)體法將miR-16或陰性對照的寡核苷酸轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h后，進(jìn)行后續(xù)實驗:在倒置相差顯微鏡下，觀察細(xì)胞的狀態(tài)和數(shù)量;通過MTT法測定各組細(xì)胞的吸光度值，并通過公式計算細(xì)胞生長抑制率;AnnexinV-FITC和PI雙染后，通過流式細(xì)胞儀檢測miR-16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率;通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測miR-16與BDNF的相關(guān)性;通過Westernblotting

11、技術(shù)檢測miR-16轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后BDNF的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　SH-SY5Y細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-16后，細(xì)胞數(shù)量較正常對照和轉(zhuǎn)染NC組明顯減少，細(xì)胞密度降低，同時細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化，貼壁程度有所減輕;MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果表明，較正常對照組和NC組，miR-16轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高（見圖7），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)t檢驗分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。AnnexinV-FITC/PI雙染后，轉(zhuǎn)染

12、miR-16的實驗組細(xì)胞凋亡率達(dá)到33.7％，與對照組相比明顯升高;為了證實miR-16與BDNF之間的相關(guān)性，我們通過生物信息學(xué)分析的方法，發(fā)現(xiàn)在BDNF-3'-UTR存在miR-16的匹配位點;進(jìn)一步通過Westernblotting檢測，結(jié)果顯示，BDNF在miR-16作用后表達(dá)量明顯降低。
　　結(jié)論:
　　miR-16可以發(fā)揮抑癌基因的功能，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡;BDNF-3'-UTR區(qū)域存在miR-16的匹配

13、位點;miR-16可以下調(diào)癌基因BDNF的表達(dá)而發(fā)揮作用。
　　第三部分，順鉑對SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤的抑制及機(jī)制研究
　　目的:
　　在個體水平，探討順鉑對裸鼠移植瘤生長的影響;進(jìn)一步證明順鉑可以影響移植瘤細(xì)胞中miR-16和BDNF的表達(dá)，在個體水平證明順鉑可以升高miR-16的表達(dá)，而后者可進(jìn)一步下調(diào)BDNF的表達(dá)。
　　方法:
　　大量培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，準(zhǔn)備注射到裸鼠背部皮下造模;通過腹腔注

14、射戊巴比妥鈉使裸鼠麻醉后，每個點注射1×107個SH-SY5Y細(xì)胞;當(dāng)腫瘤體積增大到大約100mm3時，對實驗組動物腹腔注射順鉑進(jìn)行干預(yù)，順鉑用量為3mg/kg，對照組腹腔注射等體積的生理鹽水;順鉑每四天注射1次，共治療4次;最后一次注射結(jié)束后的第四天，將裸鼠處死，然后將瘤體從背部皮下取出;將同組處理的瘤體放在一起觀察，拍照;用電子天平稱量每個瘤體的重量，記錄并計算均值;提取細(xì)胞RNA，通過實時定量PCR檢測瘤體細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)

15、水平;提取瘤體內(nèi)總蛋白后，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印、抗體雜交等步驟，最后放入化學(xué)發(fā)光成像儀，拍照觀察蛋白條帶，分析BDNF在裸鼠移植瘤內(nèi)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　注射SH-SY5Y細(xì)胞至裸鼠背部皮下后，每天觀察成瘤情況，并測量估算瘤體大小;約5-7天后，瘤體體積達(dá)到大約100mm3，開始使用順鉑對實驗組裸鼠進(jìn)行干預(yù);治療完畢，取出細(xì)胞移植瘤，可見順鉑處理組腫瘤體積明顯減小，順鉑在裸鼠體內(nèi)可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖;使用精密電

16、子天平稱量瘤體的重量，注射生理鹽水組的瘤重為0.135±0.015g，而順鉑干預(yù)后瘤重為0.057±0.018g;實時定量PCR檢測瘤體內(nèi)miR-16的表達(dá)，結(jié)果顯示與對照組相比，在順鉑干預(yù)后，瘤體內(nèi)miR-16表達(dá)顯著升高，這一結(jié)果與細(xì)胞水平的實驗結(jié)果是一致的;Westernblotting檢測SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤體內(nèi)BDNF的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在順鉑干預(yù)后，瘤體細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)水平顯著減低。
　　結(jié)論:
　　順鉑可以抑制

17、裸鼠SH-SY5Y細(xì)胞移植瘤的生長;順鉑可以增加瘤體細(xì)胞內(nèi)miR-16的表達(dá)水平，相反，瘤體內(nèi)BDNF的表達(dá)水平降低。
　　三部分整體結(jié)論:
　　順鉑可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，也可以抑制SH-SY5Y細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長;順鉑可以通過升高miR-16的表達(dá)發(fā)揮作用，而miR-16可以抑制細(xì)胞和裸鼠移植瘤體內(nèi)BDNF的表達(dá);在細(xì)胞和個體水平，順鉑都能通過上調(diào)miR-16表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)BDNF表達(dá)，來