葫蘆素B對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的抑制作用機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)母細(xì)胞瘤（Neuroblastoma, NB）是一種顱外惡性實(shí)體腫瘤，在兒童中最為常見，又成為“兒童癌癥之王”。它起源于外周交感神經(jīng)系統(tǒng)，是由發(fā)育中的脊髓外層遷移過來的神經(jīng)母細(xì)胞或原始神經(jīng)嵴細(xì)胞衍化而來的，占兒童癌癥死亡總數(shù)的10％左右。在臨床表現(xiàn)上，由于患者年齡大小、腫瘤發(fā)生部位、所處范圍以及生物學(xué)特征的不同，NB的臨床表現(xiàn)也是多種多樣，因此對患者的預(yù)后也有很大差異。目前NB的治療方法主要包括單純觀察、手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療

2、以及生物治療等，根據(jù)患者所處的高、中、低風(fēng)險分組的不同，治療強(qiáng)度也有所區(qū)別。盡管近年來隨著早期診斷技術(shù)的不斷的發(fā)展，NB患者的生存率也在顯著升高，但是高風(fēng)險組患者的5年生存率依然很低。目前，化學(xué)治療在神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療中仍然扮演著重要角色，由于化療給病人帶來的痛苦和副作用比較嚴(yán)重等原因，因而使尋找新型的高效低毒藥物成了目前迫在眉睫的任務(wù)。
　　葫蘆素B是從葫蘆科植物中分離出來的一種四環(huán)三萜化合物，具有多種藥理學(xué)作用，如抗病毒、抗炎

3、及抗癌等活性。由于其具有顯著的抗炎活性，因此在傳統(tǒng)的使用上主要用于慢性肝炎的治療。最受廣泛關(guān)注的是葫蘆素B的抗癌活性，它在多種腫瘤細(xì)胞中能通過不同的分子作用機(jī)制抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，成為潛在的抗癌藥物。目前關(guān)于葫蘆素B對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的作用還未知，更沒有其對該腫瘤細(xì)胞作用機(jī)理方面的研究。因此，本文以體外培養(yǎng)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞為材料，首先對葫蘆素B對該細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行檢測，并在此基礎(chǔ)上對葫蘆素B抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分子作

4、用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。主要研究結(jié)果如下：
　　1）葫蘆素B能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的增殖。采用MTT法檢測了葫蘆素B對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，葫蘆素B能濃度和時間依賴性的抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖；PI單染后使用流式細(xì)胞儀檢測了葫蘆素B處理24 h后細(xì)胞周期分布的變化，發(fā)現(xiàn)隨著藥物處理濃度的增加，處于G2/M期細(xì)胞數(shù)目積累，細(xì)胞周期出現(xiàn)G2/M期阻滯。
　　2）

5、葫蘆素B能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、線粒體膜去極化和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升。采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測了葫蘆素B對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明，葫蘆素B能夠濃度依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡；使用倒置光學(xué)顯微鏡和Hoechst33258染色后熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)過葫蘆素B處理前后細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)變化；DCFH-DA探針、JC-1熒光探針和Fluo-3 AM熒光探針分別檢測了葫蘆

6、素B處理前后細(xì)胞內(nèi)ROS、線粒體膜電位以及Ca2+等生理水平的變化，結(jié)果顯示，葫蘆素B處理后ROS出現(xiàn)積累，線粒體膜電位下降，胞漿內(nèi)鈣離子濃度上升，且均呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。
　　3）葫蘆素B通過調(diào)控與G2/M期運(yùn)轉(zhuǎn)相關(guān)的蛋白及與凋亡相關(guān)的Bcl-2家族蛋白的表達(dá)水平來誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞周期阻滯和凋亡，同時還能濃度依賴性的上調(diào)p53和p21的表達(dá)以及下調(diào)與腫瘤血管生成和細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)。采用RT-PCR和Western

7、 blot技術(shù)檢測了葫蘆素B處理24 h后，與細(xì)胞G2/M期運(yùn)轉(zhuǎn)和凋亡的相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果顯示，葫蘆素B能夠濃度依賴性的抑制Cyclin B1、CDK1和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄與翻譯水平，而上調(diào)凋亡蛋白Bax的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。此外，還檢測了葫蘆素B對caspase-3和9的活性以及p53和p21蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果表明，葫蘆素B也能濃度依賴性的活化caspase-3和9，并促進(jìn)p53和p21的表達(dá)。同時Western blot結(jié)果

8、顯示，葫蘆素B還能抑制與血管生成相關(guān)的VEGF蛋白、與細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的MMP-2, MMP-9和COX-2蛋白的表達(dá)。
　　4）葫蘆素B通過抑制JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。JAK2/STAT3信號通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡中起著重要作用。因此，首先通過Western blot法檢測了葫蘆素B處理24 h后該信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，葫蘆素B能濃度依賴性的

9、抑制p-JAK2和 p-STAT3的表達(dá)，而本底的JAK2和STAT3則沒有明顯的變化。使用該信號通路的抑制劑AG490和激活劑IL-6檢測了蛋白的變化，結(jié)果進(jìn)一步證明了葫蘆素B能顯著抑制該信號通路的激活。為了檢測該信號通路與細(xì)胞增殖和凋亡的關(guān)系，采用了MTT和流式細(xì)胞儀檢測了葫蘆素B和抑制劑、激活劑處理后細(xì)胞增殖率和凋亡率的變化，結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了葫蘆素B能夠通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活來抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖和凋亡。

10、
　　5）MAPKs信號通路也參與調(diào)控葫蘆素B誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制和凋亡。MAPKs在細(xì)胞的生長增殖和分化與凋亡中也扮演重要角色。因此，通過Western blot法檢測葫蘆素B對該信號通路蛋白的影響，結(jié)果顯示，葫蘆素B能濃度依賴性的抑制ERK的激活，同時促進(jìn)JNK和p38 MAPK的激活。通過使用以上三種蛋白的抑制劑PD98059、SP600125和SB203580檢測蛋白表達(dá)變化，進(jìn)一步證明葫蘆素B能誘導(dǎo)該信號通路