鄰苯二甲酸丁芐酯對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞類雌激素樣作用的影響.pdf

1、鄰苯二甲酸丁芐酯（Butyl benzyl phthalate，BBP）是目前應(yīng)用廣泛的鄰苯二甲酸酯類（phthalate esters，PAEs）之一，具有內(nèi)分泌干擾作用。BBP 作為增塑劑、軟化劑、載體及添加劑，廣泛用于塑料、汽車、潤(rùn)滑劑、化妝品、服裝、農(nóng)藥等行業(yè)。在生產(chǎn)過(guò)程中，由于BBP 并未與這些PVC共價(jià)牢固結(jié)合，隨著塑料的大量使用、廢棄，而使該化合物逐漸釋放入環(huán)境中，對(duì)人群健康產(chǎn)生危害。人類BBP暴露的最重要途徑就是食品，主

2、要來(lái)源是PVC 食品包裝材料。
　　 近年來(lái)，BBP的毒性逐漸受到關(guān)注。據(jù)估計(jì)，成年人的BBP 暴露量為平均8μg/kg/d，最高可達(dá)20 μg/kg/d，而嬰兒和兒童的暴露大約是成人的3倍。另有研究發(fā)現(xiàn)，Puerto Rico 大學(xué)的Ivelisse Colon 應(yīng)用氣質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）技術(shù)測(cè)定了波多黎各島41 名性早熟女童與35名發(fā)育正常女童的血液樣品，發(fā)現(xiàn)性早熟女童血液中BBP、DMP、DEP、DBP、DEHP的濃度明顯

3、高于對(duì)照組，在排除其他因素的干擾前提下，推測(cè)PAEs 可能與當(dāng)?shù)嘏缡煊嘘P(guān)。
　　 眾多學(xué)者研究認(rèn)為，BBP 作為一類雌激素類物質(zhì)，進(jìn)入人體后，可與相應(yīng)的激素受體結(jié)合，干擾體內(nèi)正常水平激素的維持，從而影響人的生長(zhǎng)、發(fā)育和行為。如人體長(zhǎng)期、慢性接觸 BBP，可導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂、生殖機(jī)能失常等。BBP 還可通過(guò)胎盤和授乳產(chǎn)生跨代影響。本室以往研究發(fā)現(xiàn)，母鼠妊娠期和哺乳期接觸BBP，F(xiàn)1 代大鼠腦組織CREST、BDNF、spinop

4、hilin mRNA表達(dá)均降低，且對(duì)雄性仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力造成損害。
　　 綜上所述，BBP的毒性作用不容忽視。以往對(duì)于BBP的污染以及危害的研究仍具有一定的局限性，因此有必要對(duì)其毒作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y細(xì)胞）為模型，研究BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞類雌激素樣作用的影響，將為進(jìn)一步了解BBP的神經(jīng)毒作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 第一部分 BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用
　　

5、 BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響
　　 目的：探討B(tài)BP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響。
　　 方法：CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果：（1）確定染毒時(shí)間為24 h，E2 染毒劑量為0.1 μmol/L，雌激素受體拮抗劑（ICI182,780）劑量為1 μmol/L；（2）0.01、0.1 μmol/L的BBP和0.1 μmol/LE2 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率分別為113.10％、114.

6、76％和115.45％，與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；30、300 μmol /L BBP組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（3）BBP、E2 可促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖作用，而ICI182,780 可逆轉(zhuǎn)BBP、E2的細(xì)胞增值作用。
　　 結(jié)論：低劑量與高劑量BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生不同的效應(yīng)，BBP的毒性作用可能是雌激素受體（ER）介導(dǎo)的。
　　 BBP 對(duì)SH-S

7、Y5Y細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：研究BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響，并初步探討B(tài)BP 誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。
　　 方法：流式細(xì)胞儀PI-Annexin V 雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：（1）100、300 ?mol/L BBP組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率明顯升高，與對(duì)照組比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；（2）0.01、0.1 ?mol/L BBP和0.1 ?mol/LE2

8、 可顯著降低SH-SY5Y細(xì)胞的早期凋亡率和總凋亡率，與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；（3）ICI182,780 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)0.1 μmol/L BBP和E2 促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的升高作用。
　　 結(jié)論：低劑量BBP 促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡率降低；高劑量BBP抑制SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ICI182,780 可以誘導(dǎo)BBP和E2 引起的細(xì)胞凋亡。
　　 第二部分

9、 BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞分泌雌激素的影響
　　 目的：探討B(tài)BP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞分泌雌激素水平的影響。
　　 方法：ELISA 法檢測(cè)BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清中雌激素水平的影響。
　　 結(jié)果：（1）0.01、0.1、10 μmol/LBBP組SH-SY5Y細(xì)胞分泌雌激素水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；（2）其他劑量BBP組SH-SY5Y細(xì)胞雌激素水平未見變化；（3）I

10、CI182,780 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)0.1 μmol/LBBP的雌激素水平升高作用。
　　 結(jié)論：低劑量組BBP 可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞雌激素的分泌，并可能與ER 有關(guān)。
　　 第三部分 BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶的影響
　　 目的：探討B(tài)BP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶的影響及其可能機(jī)制。
　　 方法：ELISA 法檢測(cè)BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶活性的影響；免疫熒光化學(xué)法、流式細(xì)胞術(shù)

11、間接標(biāo)記法、Western blotting 法和熒光定量PCR法檢測(cè)芳香化酶的表達(dá)。
　　 結(jié)果：（1）0.01、0.1 μmol/L BBP組SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶活性明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ICI182,780 預(yù)處理可抑制0.1 μmol/L BBP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶活性的升高作用；（2）免疫熒光化學(xué)法得到芳香化酶主要表達(dá)在SH-SY5Y的細(xì)胞漿中；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1、1

12、 μmol/L BBP組SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶的表達(dá)升高；western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，0.01、0.1、30 μmol/L的BBP組SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶蛋白顯著升高；0.01、0.1、30 μmol/LBBP組SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶mRNA表達(dá)增加；（3）ICI182,780 預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)0.1 μmol/L BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞芳香化酶表達(dá)的影響。
　　 結(jié)論：低劑量的BBP 上調(diào)SH-S

13、Y5Y細(xì)胞芳香化酶的活性和表達(dá)，ICI182,780預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)芳香化酶活性和表達(dá)的變化，提示BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用可能是ER 介導(dǎo)的。
　　 第四部分 BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞雌激素受體表達(dá)的影響
　　 目的：探討B(tài)BP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ER表達(dá)的影響。
　　 方法：Real time-PCR法測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞中Erα及ErβmRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：（1）0.01

14、 μmol/L BBP組SH-SY5Y細(xì)胞ErβmRNA表達(dá)降低，與E2作用效應(yīng)一致；（2）0.1、1、10 μmol/L組SH-SY5Y細(xì)胞ErβmRNA表達(dá)未見變化；（3）30、100、300 μmol/L BBP組Erβ基因表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（4）未檢測(cè)出Erα的基因表達(dá)。
　　 結(jié)論：不同劑量BBP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ErβmRNA表達(dá)的影響不同，提示作用機(jī)制可能存在差異。
　　 第五部分 BBP

15、 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞CREB 蛋白表達(dá)的影響
　　 目的：探討B(tài)BP 對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞CREB表達(dá)的影響。
　　 方法：Western blotting 法測(cè)定SH-SY5Y細(xì)胞中CREB 蛋白表達(dá)的水平。
　　 結(jié)果：（1）0.01、0.1、30、100 μmol/L的BBP 上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞CREB蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；（2）ICI182,780 可逆轉(zhuǎn)0.1 μmol/L