鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響及機(jī)制初探.pdf

1、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）是目前用量較大的鄰苯二甲酸酯類（Phthalate esters，PAEs）化合物的重要成員，是一種重要的內(nèi)分泌干擾物。DBP主要用作纖維素樹脂、聚氯乙烯、以及橡膠制品的增塑劑、軟化劑，同時(shí)也是生產(chǎn)油漆、粘接劑、藥物制劑等多種工業(yè)品的重要原料。在生產(chǎn)過程中，由于DBP并未與這些產(chǎn)品牢固結(jié)合，就會(huì)從中不斷釋放進(jìn)入環(huán)境，對(duì)人群健康產(chǎn)生危害。
　　 據(jù)美國NTP估計(jì)，一般人

2、群通過各種途徑接受DBP的暴露水平為2-10 μg/kg體重/天。當(dāng)DBP進(jìn)入機(jī)體后，可迅速代謝為鄰苯二甲酸單丁酯（Mono-butyl phthalate，MBP），后者是DBP引起發(fā)育毒性效應(yīng)的罪魁禍?zhǔn)?。目前很多研究表明DBP的危害主要是其生殖和發(fā)育毒性。DBP的毒性機(jī)制主要源于其對(duì)內(nèi)分泌的干擾作用，體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)表明DBP具有雌激素和/或抗雄激素的活性，并能影響體內(nèi)甾體合成的多種酶的活性。然而DBP對(duì)神經(jīng)行為發(fā)育的影響目前尚不清楚

3、。
　　 中樞神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育時(shí)期對(duì)體內(nèi)多種激素水平的變化非常敏感，若此期間暴露于內(nèi)分泌干擾物DBP，其發(fā)育和功能很可能受到影響。流行病學(xué)資料提示DBP具有神經(jīng)毒性，但由于是多種PAEs的混合暴露，其結(jié)果尚具有不確定性。神經(jīng)行為指標(biāo)不僅是反映內(nèi)分泌干擾物對(duì)機(jī)體作用的敏感指標(biāo)，也是化合物對(duì)多器官系統(tǒng)作用的綜合反映。本研究主要從神經(jīng)行為發(fā)育的角度，對(duì)DBP的毒性作用及其機(jī)制進(jìn)行初步探討，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)DBP的危害。
　　 研究以

4、大鼠為對(duì)象，通過在妊娠期和哺乳期染毒，采用一系列神經(jīng)行為測(cè)試組合，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)試DBP對(duì)F1大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響。多劑量組、大樣本、跨代長(zhǎng)期染毒是本研究的特點(diǎn)。由于發(fā)現(xiàn)DBP可影響子代雄性大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶，機(jī)制研究中以其為代表，采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)在發(fā)育期間不同時(shí)間點(diǎn)仔鼠海馬中與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，采用電生理的方法檢測(cè)大鼠海馬齒狀回的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）能力的改變，初步

5、探討DBP對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和功能的影響，進(jìn)一步了解DBP的神經(jīng)毒性作用機(jī)制，為DBP污染的防治工作提供重要的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 第一部分：DBP對(duì)F0雌性大鼠生殖和F1仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響
　　 目的：研究DBP對(duì)F0雌性大鼠生殖和F1仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響。
　　 方法：Wistar妊娠大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照、低、次低、次高、高5個(gè)劑量組，每組11～13只。從GD6起，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別喂飼給予質(zhì)量百分比含

6、量為0.037%、0.111%、0.333%和1%的DBP染毒孕、母鼠及F1仔鼠至PND28，對(duì)照組飼料不含DBP。觀察孕鼠的體重、進(jìn)食量、染毒后的一般情況以及生殖情況；觀察測(cè)量仔鼠的體重變化、早期生理發(fā)育指標(biāo)（體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、肛殖距、張耳、出牙、開眼）；染毒結(jié)束時(shí)解剖檢查各主要臟器情況并稱量計(jì)算臟器系數(shù)。
　　 結(jié)果：(1)各實(shí)驗(yàn)組孕鼠的進(jìn)食量和體重隨妊娠天數(shù)逐漸增加，但與對(duì)照組比較，其增量未見明顯改變（p>0.05）。(2)各實(shí)

7、驗(yàn)組孕鼠未見明顯中毒癥狀，妊娠失敗率、每窩活仔數(shù)、窩仔性別比與對(duì)照相比無明顯差異（p>0.05），但高劑量組的妊娠期較對(duì)照組稍延長(zhǎng)（p<0.05）。(3)高劑量組雌性和雄性仔鼠在PND0～28期間體重明顯低于對(duì)照組的同性別仔鼠，差異有顯著性（p<0.01）。(4)高劑量組雄性仔鼠的肛殖距（體重立方根標(biāo)準(zhǔn)化）顯著降低（p<0.01），而各劑量組雌性仔鼠肛殖距未見明顯改變（p>0.05）。(5)各實(shí)驗(yàn)組仔鼠的張耳、出牙和開眼的天齡與對(duì)照組比

8、較無顯著差異（p>0.05）。(6)PND28齡高劑量組仔鼠（雌和雄）肝臟系數(shù)顯著增加（p<0.01），高、次高劑量組雌性仔鼠脾臟系數(shù)和高劑量組雄性仔鼠睪丸系數(shù)顯著降低（p<0.01），各實(shí)驗(yàn)組腦、心、肺、腎和子宮臟器系數(shù)未見明顯改變（p>0.05）。
　　 結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)的染毒方式、時(shí)間和劑量下，未見DBP對(duì)F0雌鼠的生殖能力產(chǎn)生明顯的毒性作用，但高劑量DBP顯著影響F1仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育并具有明顯的臟器毒性，主要表現(xiàn)仔鼠體重減輕

9、、肛殖距（雄）縮短、肝臟脾臟和睪丸的臟器系數(shù)的改變。
　　 第二部分：DBP對(duì)F1大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響
　　 目的：研究DBP暴露對(duì)F1大鼠神經(jīng)行為發(fā)育的影響。
　　 方法：孕鼠、仔鼠的分組染毒同第一部分。在出生后特定的天齡，每窩選擇仔鼠進(jìn)行平面翻正（PND4，7）、負(fù)趨地性（PND4，7）、懸崖回避（PND7）、前肢懸掛（PND10）、空中翻正（PND16）等行為功能測(cè)試，檢測(cè)DBP對(duì)早期行為發(fā)育的影響；選擇

10、4周齡仔鼠進(jìn)行開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DBP對(duì)仔鼠活動(dòng)度的影響；選擇5周齡仔鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)DBP對(duì)F1仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。
　　 結(jié)果：(1)早期行為發(fā)育指標(biāo)：PND7高劑量組雄性仔鼠平面翻正的評(píng)分顯著低于對(duì)照組，差異有顯著性（p<0.05），高劑量和低劑量組雄性仔鼠PND10前肢懸掛時(shí)間較對(duì)照組顯著降低（p<0.05），但在PND4的平面翻正以及各時(shí)間點(diǎn)的懸崖回避、負(fù)趨地性和空中翻正試驗(yàn)中不論是雄性還是雌性仔鼠

11、都未見有顯著的影響。(2)開闊場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：各實(shí)驗(yàn)組仔鼠的跨格子數(shù)、跨格的分布、后腿站立次數(shù)以及停留超過0.5s的次數(shù)比較，既無處理效應(yīng)的差異也無性別效應(yīng)的差異（p>0.05），合并性別比較也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異（p>0.05）。(3)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：①在隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)中，性別和訓(xùn)練天數(shù)有明顯的交互作用（p<0.01），高劑量組的雄性仔鼠在訓(xùn)練的第3-5天顯示比對(duì)照組較好的空間學(xué)習(xí)能力（p<0.05），但低劑量組雄性仔鼠在訓(xùn)練的第4-5

12、天顯示比對(duì)照組較差的空間學(xué)習(xí)能力（p<0.05）；各實(shí)驗(yàn)組雌性仔鼠的學(xué)習(xí)能力與對(duì)照組比較無顯著改變。②在空間探索試驗(yàn)中，低劑量組和次低劑量組雄性仔鼠的空間偏好（反映空間記憶）顯著低于對(duì)照組（p<0.05）；各實(shí)驗(yàn)組雌性仔鼠的空間偏好與對(duì)照組比較無顯著改變。③可視平臺(tái)試驗(yàn)：各實(shí)驗(yàn)組仔鼠（雄性和雌性）的逃避潛伏期和游泳路程與對(duì)照比較差異都無顯著性（p>0.05）。
　　 結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)條件下，DBP暴露對(duì)F1雄性大鼠的早期神經(jīng)行為發(fā)

13、育以及空間學(xué)習(xí)記憶有一定的影響，但對(duì)F1雌性大鼠的影響卻很少，其作用表現(xiàn)出明顯的性別差異和非單調(diào)的劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　 第三部分：DBP對(duì)雄性仔鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
　　 目的：研究DBP對(duì)雄性大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討DBP的神經(jīng)毒性作用機(jī)制。
　　 方法：妊娠Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照、低、次低、次高、高5個(gè)劑量組，每組8～10只。自GD6起，每日灌

14、胃給予玉米油（溶劑）、25mg/kg，75 mg/kg、225 mg/kg、675mg/kg的DBP染毒孕、母鼠至PND21；取PND1，7，21雄性仔鼠的海馬，用熒光定量RT-PCR檢測(cè)c-fos、BDNF (all variants)、Spinophilin、PSD95、Synaptophysin、CREST、BDNF variant Ⅲ等基因的表達(dá)；用Western blot檢測(cè)PND21雄性仔鼠海馬BDNF、p-CREB、Spi

15、nophilin和芳香化酶蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)論：妊娠期和哺乳期高劑量的DBP暴露可促進(jìn)雄性仔鼠海馬BDNF、Spinophilin和芳香化酶的表達(dá)，提示其可能促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、樹突棘增多；高劑量DBP暴露促進(jìn)BDNF表達(dá)的作用與上游CREB的激活調(diào)控作用無關(guān)；DBP暴露可能不會(huì)影響雄性大鼠海馬的突觸結(jié)構(gòu)和功能。
　　 第四部分：DBP對(duì)雄性大鼠成年后學(xué)習(xí)記憶以及血清生化指標(biāo)和海馬LTP的影響
　　

16、 目的：研究發(fā)育期間DBP暴露對(duì)雄性大鼠成年后學(xué)習(xí)記憶的影響，研究DBP長(zhǎng)期暴露對(duì)雄性大鼠血清生化指標(biāo)和海馬齒狀回LTP的影響。
　　 方法：第3部分中的剩余雄性大鼠，1只/窩/組，繼續(xù)以同樣的方式和劑量染毒至PND28，在1月齡和2月齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)；保留高劑量組、低劑量組和對(duì)照組繼續(xù)染毒至3月齡，尾尖采血檢測(cè)生化指標(biāo)，在體測(cè)定海馬齒狀回LTP。
　　 結(jié)論：高劑量DBP染毒的雄性大鼠在近成年時(shí)仍然表現(xiàn)

17、出較好的學(xué)習(xí)記憶能力，可能是源于早期DBP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響；高劑量DBP長(zhǎng)期暴露對(duì)成年雄性大鼠有明顯的肝臟毒性；DBP長(zhǎng)期暴露對(duì)雄性大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的突觸傳遞功能影響不明顯。
　　 綜上4個(gè)部分研究所述，在本實(shí)驗(yàn)的研究條件下，發(fā)現(xiàn)高劑量的DBP具有明顯的生殖毒性、發(fā)育毒性和肝臟毒性。對(duì)早期神經(jīng)行為而言，DBP對(duì)雌性仔鼠的影響不明顯，但對(duì)雄性仔鼠有一定的影響，表現(xiàn)為平面翻正、前肢懸掛等行為功能的異常。然而在高劑量時(shí)卻促進(jìn)