鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞功能影響及機(jī)制研究.pdf

1、課題組前期研究發(fā)現(xiàn)流經(jīng)重慶城區(qū)的嘉陵江及長(zhǎng)江水水源中鄰苯二甲酸酯(PAEs)和多環(huán)芳烴(PAHs)污染特別突出，而鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和苯并(a)芘(BaP)分別是這兩種化合物的典型代表。鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘都是持續(xù)性有機(jī)污染物，也屬于公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。由于它們常常共存于水中，對(duì)人體的暴露屬于低劑量聯(lián)合暴露。雖然已有研究認(rèn)為DBP和BaP均有雄性生殖毒性，但到目前為止還沒有見到這兩種化合物同時(shí)暴露對(duì)生殖毒性的影響的

2、報(bào)告，因此，很有必要對(duì)兩者的聯(lián)合作用進(jìn)行研究。同時(shí)，已有大量研究發(fā)現(xiàn)DBP和BaP可能通過睪丸細(xì)胞，如支持細(xì)胞、Leydig細(xì)胞、及生精細(xì)胞來影響睪丸的功能，而對(duì)于睪丸巨噬細(xì)胞的研究卻沒有。由于睪丸巨噬細(xì)胞作為一類特殊的免疫分泌細(xì)胞與Leydig細(xì)胞比鄰于睪丸間質(zhì)，對(duì)維持睪丸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用，也能通過旁分泌作用分泌因子調(diào)節(jié)Leydig細(xì)胞的功能。因此，本研究通過觀察DBP和BaP對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞的功能的影響以及對(duì)睪酮合成的影響，從

3、睪丸巨噬細(xì)胞的角度來探索DBP和BaP對(duì)睪酮合成影響的內(nèi)在機(jī)制，為今后的研究提供基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)。
　　 方法：
　　 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：亞慢性低劑量暴露
　　 (1)動(dòng)物分組及染毒劑量
　　 大鼠被隨機(jī)分成7組，24只/組，溶劑對(duì)照組(CON)、DBP50mg/kg組(DBP-50)、DBP250mg/kg組(DBP-250)、BaP1mg/kg組(BaP-1)、BaP5mg/kg組(BaP-5)、DBP50m

4、g/kg+BaP1mg/kg聯(lián)合暴露組(D+B-50+1)、DBP250mg/kg+BaP5mg/kg聯(lián)合暴露組(D+B-250+5)。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：隔日等體積灌胃，連續(xù)染毒90天。分別在染毒后的30d、60d和90d，取材，通過常規(guī)H.E染色、RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色、Western blot、放射免疫法等方法，觀察和分析DBP和BaP對(duì)一般毒理學(xué)指標(biāo)、睪丸巨噬細(xì)胞功能(包括亞型表達(dá)、分泌因子的改變、吞噬相關(guān)酶

5、的改變)以及睪丸內(nèi)睪酮產(chǎn)量的影響。
　　 2、體外實(shí)驗(yàn)：體外低劑量暴露
　　 先建立體外睪丸巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)后染毒，共分八組：空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，六個(gè)染毒實(shí)驗(yàn)組：DBP-0.1組，DBP-10組(DBP終濃度分別為0.1μg/ml，10μg/ml)，BaP-0.01組，BaP-1組(BaP終濃度分別為0.01μg/ml，1μg/ml)，聯(lián)合染毒組D+B-0.1+0.01組，D+B-10+1組(DB

6、P0.1μg/ml+BaP0.01μg/ml；DBP0.1μg/ml+BaP0.01μg/ml)。染毒24小時(shí)后，收集細(xì)胞觀察睪丸巨噬細(xì)胞凋亡情況，以及中性紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其吞噬功能，上清則用ELISA法檢測(cè)IL-1β和TNF-α水平。從體外來進(jìn)一步證實(shí)和探索DBP和BaP對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞的損傷機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1、DBP和BaP染毒后對(duì)生殖系統(tǒng)及其它主要臟器的一般毒理學(xué)指標(biāo)的影響
　　 (1)低劑量DBP和B

7、aP暴露對(duì)大鼠的體重和神經(jīng)行為均沒有明顯影響。
　　 (2)對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響主要表現(xiàn)在附睪系數(shù)和肝臟系數(shù)的改變。
　　 (3)低劑量DBP和BaP暴露，對(duì)睪丸、附睪和肝臟的形態(tài)學(xué)改變明顯，睪丸形態(tài)學(xué)改變特點(diǎn)是：各染毒組生精上皮明顯減少及上皮內(nèi)的空泡樣變性。附睪形態(tài)改變特點(diǎn)主要是：管內(nèi)的精子數(shù)目減少。肝臟形態(tài)學(xué)改變主要表現(xiàn)在：各染毒組，不論是DBP還是BaP組，都有明顯的肝竇增寬的特點(diǎn)，而聯(lián)合染毒高劑量組還可見點(diǎn)狀肝細(xì)

8、胞壞死。
　　 (4)低劑量DBP和BaP暴露，對(duì)附睪精子數(shù)目的影響主要表現(xiàn)在60天時(shí)，DBP-250組和D+B-250+5組對(duì)精子數(shù)目明顯降低，聯(lián)合暴露時(shí)DBP的主導(dǎo)作用明顯。
　　 2、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響
　　 (1)DBP和BaP暴露時(shí)分泌的IL-1β在mRNA和蛋白水平都明顯增高，這種mRNA在90天時(shí)才表現(xiàn)明顯；DBP和BaP暴露與IL-1β mRNA水平的增高

9、沒有劑量依賴效應(yīng)。DBP和BaP聯(lián)合暴露對(duì)分泌IL-1β水平的增加呈現(xiàn)出相加作用，其中DBP-250組對(duì)于IL-1β蛋白水平表達(dá)的增加表現(xiàn)突出。
　　 (2)DBP和BaP暴露時(shí)分泌的TNF-α mRNA和蛋白水平都下降，DBP和BaP聯(lián)合染毒對(duì)TNF-α蛋白表達(dá)同樣具備相加的作用。
　　 (3)DBP與BaP暴露對(duì)iNOS mRNA和蛋白水平的影響總體來說是顯著降低其表達(dá)水平，但是其染毒水平須保持在DBP250mg/k

10、g/d，BaP5mg/kg/d的劑量水平。雖然單獨(dú)暴露時(shí)，兩者在低劑量水平變化不明顯，但當(dāng)兩者在此劑量下聯(lián)合暴露時(shí)，其iNOSmRNA水平出現(xiàn)明顯降低，提示DBP與BaP能交互作用，觸發(fā)與單獨(dú)暴露截然不同的效應(yīng)。
　　 3、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞亞型的影響
　　 DBP和BaP暴露改變了睪丸巨噬細(xì)胞亞型表達(dá)的平衡，主要表現(xiàn)在使ED1亞型表達(dá)在90天內(nèi)呈持續(xù)增高的趨勢(shì)；ED2亞型先在30天時(shí)出現(xiàn)短暫的

11、大幅降低(這種表現(xiàn)主要表現(xiàn)在聯(lián)合暴露D+B-50+1組)，然后在90天時(shí)，整體水平又逐漸回升，但高劑量聯(lián)合組(D+B-250+5)依然低于對(duì)照組的平均水平，出現(xiàn)不可逆的改變。
　　 4、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞吞噬功能相關(guān)酶的影響
　　 (1)DBP在50mg/kg/d的劑量水平單獨(dú)暴露下，溶菌酶水平顯著升高，存在低劑量興奮效應(yīng)。這種效應(yīng)在第30及60天時(shí)表現(xiàn)明顯。DBP和BaP聯(lián)合染毒時(shí)使溶菌酶酶水

12、平明顯下降，提示非特異性吞噬功能降低。
　　 (2)DBP和BaP染毒時(shí)，具有時(shí)間效應(yīng)，在90天內(nèi)酸性磷酸酶(ACP)水平逐漸下降，各染毒組和聯(lián)合染毒組在第90天時(shí)ACP水平均顯著低于對(duì)照組。
　　 5、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對(duì)睪酮合成的影響
　　 (1)引起睪酮合成細(xì)胞-Leydig細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變，主要表現(xiàn)在合成場(chǎng)所內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的膜改變，如髓樣改變，擴(kuò)張和水腫；聯(lián)合染毒時(shí)還有核的高度異常，出現(xiàn)固

13、縮和核內(nèi)包涵物。在不同劑量水平上，其形態(tài)學(xué)的差別不明顯。
　　 (2)在90天內(nèi)大部分染毒組睪丸組織內(nèi)睪酮水平顯著降低；DBP和BaP聯(lián)合染毒后的睪酮產(chǎn)量明顯低于單獨(dú)染毒，而且DBP和BaP兩者具有明顯的相加效應(yīng)。
　　 6、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對(duì)體外睪丸巨噬細(xì)胞損傷的機(jī)制初步探討
　　 (1)DBP、BaP在極低劑量水平(DBP0.1μg/ml，BaP0.01μg/ml)就能夠誘導(dǎo)體外睪丸巨噬細(xì)胞的凋

14、亡；相對(duì)BaP來說，睪丸巨噬細(xì)胞對(duì)DBP的低劑量暴露更加敏感；DBP和BaP對(duì)誘導(dǎo)睪丸巨噬細(xì)胞凋亡存在復(fù)雜的聯(lián)合作用。
　　 (2)DBP在高劑量水平單獨(dú)染毒和聯(lián)合高劑量染毒出現(xiàn)IL-1β分泌顯著增高，TNF-α分泌顯著減少，非特異性吞噬功能均下降，這些改變?cè)诘蛣┝克?DBP0.1μg/ml，BaP0.01μg/ml)均不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、DBP和BaP低劑量染毒對(duì)動(dòng)物主要臟器如睪丸、附睪和肝臟的

15、形態(tài)學(xué)有影響，說明這三個(gè)器官可能是DBP和BaP低劑量暴露下的毒性靶器官。
　　 2、DBP和BaP低劑量聯(lián)合染毒降低了附睪中的精子數(shù)目，相比較BaP而言，DBP在其中起著主體作用。
　　 3、在DBP于50mg/kg/d的水平單獨(dú)暴露的初期，不同于其它染毒組，ED2水平不降反而上升，溶菌酶酶活性不減弱反而增高，這里可能都存在一種低劑量興奮效應(yīng)。
　　 4、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘亞慢性、低劑量暴露后，以相

16、加的模式共同顯著降低睪酮的產(chǎn)量，并存在明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　 5、盡管DBP和BaP有著復(fù)雜的未知的聯(lián)合作用，但在對(duì)睪丸巨噬細(xì)胞功能影響方面，相加作用可能是其主要的聯(lián)合毒性作用類型。
　　 6、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘暴露使睪丸巨噬細(xì)胞分泌功能出現(xiàn)選擇性的分泌，即IL-1β的上調(diào)及TNF-α和iNOS的下調(diào)，IL-1β可能作為主要的分泌因子在睪丸局部發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　 7、DBP和BaP可能通過誘

17、導(dǎo)(ED2亞群)凋亡、改變亞群平衡，最終局部大量分泌IL-1β，并通過它發(fā)揮抑制睪酮的生成。這個(gè)可能是DBP和BaP干擾睪酮合成的巨噬細(xì)胞途徑和內(nèi)在機(jī)制之一。
　　 綜上所述，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)共同證實(shí)：睪丸巨噬細(xì)胞是鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘的毒性靶細(xì)胞，鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘能夠改變睪丸巨噬細(xì)胞亞群的平衡；降低非特異性吞噬功能，特別是改變重要因子的分泌，通過旁分泌途徑抑制Leydig細(xì)胞的睪酮類固醇合成。顯然，DBP