鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對睪丸巨噬細(xì)胞功能影響及機(jī)制研究.pdf

1、課題組前期研究發(fā)現(xiàn)流經(jīng)重慶城區(qū)的嘉陵江及長江水水源中鄰苯二甲酸酯(PAEs)和多環(huán)芳烴(PAHs)污染特別突出，而鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和苯并(a)芘(BaP)分別是這兩種化合物的典型代表。鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘都是持續(xù)性有機(jī)污染物，也屬于公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。由于它們常常共存于水中，對人體的暴露屬于低劑量聯(lián)合暴露。雖然已有研究認(rèn)為DBP和BaP均有雄性生殖毒性，但到目前為止還沒有見到這兩種化合物同時暴露對生殖毒性的影響的

2、報告，因此，很有必要對兩者的聯(lián)合作用進(jìn)行研究。同時，已有大量研究發(fā)現(xiàn)DBP和BaP可能通過睪丸細(xì)胞，如支持細(xì)胞、Leydig細(xì)胞、及生精細(xì)胞來影響睪丸的功能，而對于睪丸巨噬細(xì)胞的研究卻沒有。由于睪丸巨噬細(xì)胞作為一類特殊的免疫分泌細(xì)胞與Leydig細(xì)胞比鄰于睪丸間質(zhì)，對維持睪丸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用，也能通過旁分泌作用分泌因子調(diào)節(jié)Leydig細(xì)胞的功能。因此，本研究通過觀察DBP和BaP對睪丸巨噬細(xì)胞的功能的影響以及對睪酮合成的影響，從

3、睪丸巨噬細(xì)胞的角度來探索DBP和BaP對睪酮合成影響的內(nèi)在機(jī)制，為今后的研究提供基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)。
　　 方法：
　　 1、體內(nèi)實驗：亞慢性低劑量暴露
　　 (1)動物分組及染毒劑量
　　 大鼠被隨機(jī)分成7組，24只/組，溶劑對照組(CON)、DBP50mg/kg組(DBP-50)、DBP250mg/kg組(DBP-250)、BaP1mg/kg組(BaP-1)、BaP5mg/kg組(BaP-5)、DBP50m

4、g/kg+BaP1mg/kg聯(lián)合暴露組(D+B-50+1)、DBP250mg/kg+BaP5mg/kg聯(lián)合暴露組(D+B-250+5)。
　　 (2)實驗設(shè)計：隔日等體積灌胃，連續(xù)染毒90天。分別在染毒后的30d、60d和90d，取材，通過常規(guī)H.E染色、RT-PCR、免疫組織化學(xué)染色、Western blot、放射免疫法等方法，觀察和分析DBP和BaP對一般毒理學(xué)指標(biāo)、睪丸巨噬細(xì)胞功能(包括亞型表達(dá)、分泌因子的改變、吞噬相關(guān)酶

5、的改變)以及睪丸內(nèi)睪酮產(chǎn)量的影響。
　　 2、體外實驗：體外低劑量暴露
　　 先建立體外睪丸巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)體系，預(yù)培養(yǎng)24小時后染毒，共分八組：空白對照組和溶劑對照組，六個染毒實驗組：DBP-0.1組，DBP-10組(DBP終濃度分別為0.1μg/ml，10μg/ml)，BaP-0.01組，BaP-1組(BaP終濃度分別為0.01μg/ml，1μg/ml)，聯(lián)合染毒組D+B-0.1+0.01組，D+B-10+1組(DB

6、P0.1μg/ml+BaP0.01μg/ml；DBP0.1μg/ml+BaP0.01μg/ml)。染毒24小時后，收集細(xì)胞觀察睪丸巨噬細(xì)胞凋亡情況，以及中性紅實驗檢測其吞噬功能，上清則用ELISA法檢測IL-1β和TNF-α水平。從體外來進(jìn)一步證實和探索DBP和BaP對睪丸巨噬細(xì)胞的損傷機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1、DBP和BaP染毒后對生殖系統(tǒng)及其它主要臟器的一般毒理學(xué)指標(biāo)的影響
　　 (1)低劑量DBP和B

7、aP暴露對大鼠的體重和神經(jīng)行為均沒有明顯影響。
　　 (2)對大鼠臟器系數(shù)的影響主要表現(xiàn)在附睪系數(shù)和肝臟系數(shù)的改變。
　　 (3)低劑量DBP和BaP暴露，對睪丸、附睪和肝臟的形態(tài)學(xué)改變明顯，睪丸形態(tài)學(xué)改變特點是：各染毒組生精上皮明顯減少及上皮內(nèi)的空泡樣變性。附睪形態(tài)改變特點主要是：管內(nèi)的精子數(shù)目減少。肝臟形態(tài)學(xué)改變主要表現(xiàn)在：各染毒組，不論是DBP還是BaP組，都有明顯的肝竇增寬的特點，而聯(lián)合染毒高劑量組還可見點狀肝細(xì)

8、胞壞死。
　　 (4)低劑量DBP和BaP暴露，對附睪精子數(shù)目的影響主要表現(xiàn)在60天時，DBP-250組和D+B-250+5組對精子數(shù)目明顯降低，聯(lián)合暴露時DBP的主導(dǎo)作用明顯。
　　 2、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對睪丸巨噬細(xì)胞內(nèi)分泌功能的影響
　　 (1)DBP和BaP暴露時分泌的IL-1β在mRNA和蛋白水平都明顯增高，這種mRNA在90天時才表現(xiàn)明顯；DBP和BaP暴露與IL-1β mRNA水平的增高

9、沒有劑量依賴效應(yīng)。DBP和BaP聯(lián)合暴露對分泌IL-1β水平的增加呈現(xiàn)出相加作用，其中DBP-250組對于IL-1β蛋白水平表達(dá)的增加表現(xiàn)突出。
　　 (2)DBP和BaP暴露時分泌的TNF-α mRNA和蛋白水平都下降，DBP和BaP聯(lián)合染毒對TNF-α蛋白表達(dá)同樣具備相加的作用。
　　 (3)DBP與BaP暴露對iNOS mRNA和蛋白水平的影響總體來說是顯著降低其表達(dá)水平，但是其染毒水平須保持在DBP250mg/k

10、g/d，BaP5mg/kg/d的劑量水平。雖然單獨暴露時，兩者在低劑量水平變化不明顯，但當(dāng)兩者在此劑量下聯(lián)合暴露時，其iNOSmRNA水平出現(xiàn)明顯降低，提示DBP與BaP能交互作用，觸發(fā)與單獨暴露截然不同的效應(yīng)。
　　 3、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對睪丸巨噬細(xì)胞亞型的影響
　　 DBP和BaP暴露改變了睪丸巨噬細(xì)胞亞型表達(dá)的平衡，主要表現(xiàn)在使ED1亞型表達(dá)在90天內(nèi)呈持續(xù)增高的趨勢；ED2亞型先在30天時出現(xiàn)短暫的

11、大幅降低(這種表現(xiàn)主要表現(xiàn)在聯(lián)合暴露D+B-50+1組)，然后在90天時，整體水平又逐漸回升，但高劑量聯(lián)合組(D+B-250+5)依然低于對照組的平均水平，出現(xiàn)不可逆的改變。
　　 4、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對睪丸巨噬細(xì)胞吞噬功能相關(guān)酶的影響
　　 (1)DBP在50mg/kg/d的劑量水平單獨暴露下，溶菌酶水平顯著升高，存在低劑量興奮效應(yīng)。這種效應(yīng)在第30及60天時表現(xiàn)明顯。DBP和BaP聯(lián)合染毒時使溶菌酶酶水

12、平明顯下降，提示非特異性吞噬功能降低。
　　 (2)DBP和BaP染毒時，具有時間效應(yīng)，在90天內(nèi)酸性磷酸酶(ACP)水平逐漸下降，各染毒組和聯(lián)合染毒組在第90天時ACP水平均顯著低于對照組。
　　 5、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對睪酮合成的影響
　　 (1)引起睪酮合成細(xì)胞-Leydig細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的改變，主要表現(xiàn)在合成場所內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的膜改變，如髓樣改變，擴(kuò)張和水腫；聯(lián)合染毒時還有核的高度異常，出現(xiàn)固

13、縮和核內(nèi)包涵物。在不同劑量水平上，其形態(tài)學(xué)的差別不明顯。
　　 (2)在90天內(nèi)大部分染毒組睪丸組織內(nèi)睪酮水平顯著降低；DBP和BaP聯(lián)合染毒后的睪酮產(chǎn)量明顯低于單獨染毒，而且DBP和BaP兩者具有明顯的相加效應(yīng)。
　　 6、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘對體外睪丸巨噬細(xì)胞損傷的機(jī)制初步探討
　　 (1)DBP、BaP在極低劑量水平(DBP0.1μg/ml，BaP0.01μg/ml)就能夠誘導(dǎo)體外睪丸巨噬細(xì)胞的凋

14、亡；相對BaP來說，睪丸巨噬細(xì)胞對DBP的低劑量暴露更加敏感；DBP和BaP對誘導(dǎo)睪丸巨噬細(xì)胞凋亡存在復(fù)雜的聯(lián)合作用。
　　 (2)DBP在高劑量水平單獨染毒和聯(lián)合高劑量染毒出現(xiàn)IL-1β分泌顯著增高，TNF-α分泌顯著減少，非特異性吞噬功能均下降，這些改變在低劑量水平(DBP0.1μg/ml，BaP0.01μg/ml)均不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、DBP和BaP低劑量染毒對動物主要臟器如睪丸、附睪和肝臟的

15、形態(tài)學(xué)有影響，說明這三個器官可能是DBP和BaP低劑量暴露下的毒性靶器官。
　　 2、DBP和BaP低劑量聯(lián)合染毒降低了附睪中的精子數(shù)目，相比較BaP而言，DBP在其中起著主體作用。
　　 3、在DBP于50mg/kg/d的水平單獨暴露的初期，不同于其它染毒組，ED2水平不降反而上升，溶菌酶酶活性不減弱反而增高，這里可能都存在一種低劑量興奮效應(yīng)。
　　 4、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘亞慢性、低劑量暴露后，以相

16、加的模式共同顯著降低睪酮的產(chǎn)量，并存在明顯的劑量依賴關(guān)系。
　　 5、盡管DBP和BaP有著復(fù)雜的未知的聯(lián)合作用，但在對睪丸巨噬細(xì)胞功能影響方面，相加作用可能是其主要的聯(lián)合毒性作用類型。
　　 6、鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘暴露使睪丸巨噬細(xì)胞分泌功能出現(xiàn)選擇性的分泌，即IL-1β的上調(diào)及TNF-α和iNOS的下調(diào)，IL-1β可能作為主要的分泌因子在睪丸局部發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。
　　 7、DBP和BaP可能通過誘

17、導(dǎo)(ED2亞群)凋亡、改變亞群平衡，最終局部大量分泌IL-1β，并通過它發(fā)揮抑制睪酮的生成。這個可能是DBP和BaP干擾睪酮合成的巨噬細(xì)胞途徑和內(nèi)在機(jī)制之一。
　　 綜上所述，體內(nèi)及體外實驗共同證實：睪丸巨噬細(xì)胞是鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘的毒性靶細(xì)胞，鄰苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘能夠改變睪丸巨噬細(xì)胞亞群的平衡；降低非特異性吞噬功能，特別是改變重要因子的分泌，通過旁分泌途徑抑制Leydig細(xì)胞的睪酮類固醇合成。顯然，DBP