β羥丁酸對(duì)Aβ處理的SH-SY5Y細(xì)胞p75NTR表達(dá)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種常見(jiàn)的進(jìn)行性的神經(jīng)性病變。AD病因復(fù)雜多樣，腦內(nèi)Aβ異常聚積被認(rèn)為是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體p75NTR(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)可明顯減少Aβ斑塊沉積。同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道p75NTR可以通過(guò)其胞外段與影響Aβ聚合能力和神經(jīng)毒性的主要區(qū)域（第25-35位氨基酸）結(jié)合，發(fā)揮抑制Aβ聚集、促進(jìn)Aβ纖

2、維解聚，有效拮抗Aβ神經(jīng)毒性，保護(hù)神經(jīng)元的作用。另有研究顯示p75NTR與Aβ結(jié)合后可通過(guò)激活NF-κB p65蛋白促進(jìn)細(xì)胞存活，保護(hù)神經(jīng)元。有研究表明p75NTR在AD腦內(nèi)的表達(dá)減少。提示上調(diào)p75NTR在AD中的表達(dá)水平可能通過(guò)激活p65蛋白而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元作用。p75NTR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與組蛋白乙?；嘘P(guān)，而組蛋白乙?；娇赏ㄟ^(guò)組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)調(diào)節(jié)。人類中HDACs共有18

3、個(gè)亞型(HDAC1-11，SIRT1-7)。已有研究表明在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中HDAC1可抑制p75NTR轉(zhuǎn)錄。HDAC2與HDAC1高度同源，且HDAC2參與AD的發(fā)生發(fā)展。然而，在AD中HDAC1、HDAC2是否調(diào)控p75NTR表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。脂肪代謝的中間產(chǎn)物β羥丁酸(β-hydroxybutyrate，βOHB)對(duì)AD等神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用日益受到關(guān)注。βOHB是一種內(nèi)源性HDACs抑制劑，具有抑制包括HD

4、AC1/2在內(nèi)的HDACs作用。但βOHB在AD中是否可通過(guò)抑制HDAC1和（或）HDAC2而調(diào)控p75NTR表達(dá)尚不清楚。綜上，本研究采用Aβ25-35處理SH-SY5Y細(xì)胞作為AD的細(xì)胞模型，探討βOHB是否通過(guò)抑制AD模型細(xì)胞HDAC1/2而上調(diào)p75NTR的表達(dá)，進(jìn)而激活p65蛋白，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用。
　　研究方法:1、細(xì)胞培養(yǎng):SH-SY5Y細(xì)胞以含10％胎牛血清1640培養(yǎng)液于37℃、5％ CO2及飽和濕度條件下培

5、養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)以0.25％胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液供試。2、細(xì)胞活力測(cè)定:βOHB干預(yù)組細(xì)胞以終濃度為5 mMβOHB預(yù)處理3h，再向Aβ處理組和βOHB干預(yù)組細(xì)胞加入Aβ(終濃度為10、20、40、80μM)，同時(shí)設(shè)立空白組（加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液）和對(duì)照組（加入含細(xì)胞的培養(yǎng)液），培養(yǎng)24 h，采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力。3、細(xì)胞mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè):實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、單純?chǔ)翺HB組、Aβ處理組和βOHB干預(yù)組。單

6、純?chǔ)翺HB組、βOHB干預(yù)組細(xì)胞以5 mMβOHB預(yù)處理3h，再向Aβ處理組和βOHB干預(yù)組細(xì)胞加入終濃度為20μM Aβ的培養(yǎng)液，對(duì)照組細(xì)胞僅加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)6h、24 h，收集細(xì)胞。采用qRT-PCR及Western Blot法測(cè)定各組細(xì)胞p75NTR、HDAC1/2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平，以及p65蛋白表達(dá)水平。4、沉默HDAC1/2基因的細(xì)胞p75NTR表達(dá)水平檢測(cè):將siRNA-HDAC1/2轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞，同時(shí)

7、設(shè)立陰性對(duì)照組(NonspecificsiRNA)，于轉(zhuǎn)染后24 h，采用qRT-PCR及Western Blot法判定siRNA干擾效果，同時(shí)檢測(cè)p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平。5、統(tǒng)計(jì)分析:應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:1、隨著Aβ濃度的不斷增加，細(xì)胞活力逐漸下降，40μM、80μMAβ處理組的細(xì)胞活力明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）;與40μM、80μM Aβ處理組相比，βOHB干預(yù)組

8、細(xì)胞活力明顯升高(P＜0.01)。2、與對(duì)照組相比，6h、24 h單純?chǔ)翺HB組細(xì)胞p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平上升（P＜0.05或P＜0.01），Aβ處理組細(xì)胞p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.01）;6h、24 hβOHB干預(yù)組細(xì)胞p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平高于Aβ處理組(P＜0.01)。3、與對(duì)照組相比，6h單純?chǔ)翺HB組細(xì)胞HDAC1/2 mRNA及蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05或P＜0.01）

9、，6h、24 h Aβ處理組細(xì)胞HDAC1/2 mRNA及蛋白表達(dá)水平上升（P＜0.01）;6h、24 hβOHB干預(yù)組細(xì)胞HDAC1/2 mRNA及蛋白表達(dá)水平低于Aβ處理組（P＜0.05或P＜0.01）。4、與對(duì)照組相比，6h、24 h單純?chǔ)翺HB組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)水平升高(P＜0.01)，Aβ處理組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.01）;6h、24 hβOHB干預(yù)組細(xì)胞p65蛋白表達(dá)水平高于Aβ處理組(P＜0.01)。5、與

10、對(duì)照組相比，沉默HDAC1基因的細(xì)胞p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)，沉默HDAC2基因的細(xì)胞p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05）。
　　結(jié)論:1、βOHB可明顯抑制Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力下降。2、Aβ處理的SH-SY5Y細(xì)胞p75NTR mRNA及蛋白表達(dá)水平降低，HDAC1/2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高，p65蛋白表達(dá)水平降低;βOHB可對(duì)A