細(xì)胞外鐵離子對SH-SY5Y細(xì)胞增殖及tau蛋白磷酸化的影響.pdf

1、目的：研究細(xì)胞外鐵離子對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤系SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響。研究去磷酸化狀態(tài)下的tau蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞的表達(dá)，初步探討細(xì)胞外鐵離子對tau蛋白磷酸化狀態(tài)的影響，從而進(jìn)一步豐富對AD、PD等出現(xiàn)鐵蓄積的神經(jīng)變性疾病相關(guān)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識。 方法：正常培養(yǎng)SH．SY5Y細(xì)胞，予細(xì)胞外鐵離子溶液(FeCl<,3>)中培養(yǎng)，濃度為0.1～2mmol/L，時間分別為5mins，10mins，15mins，30mins，在倒置

2、相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，應(yīng)用MTT法，細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定鐵離子對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測0.2～0.8mmol/L的鐵離子作用5～10mins后的細(xì)胞周期及凋亡情況，并在電子顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)下和0.8mmol/L鐵離子作用10mins后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。采用細(xì)胞免疫熒光法檢測SH-SY5Y細(xì)胞去磷酸化tau蛋白的表達(dá)(應(yīng)用識別去磷酸化tau蛋白的單克隆抗體tau-1)，并在激光掃描共聚焦顯微鏡下應(yīng)用圖像

3、分析系統(tǒng)測量平均熒光強(qiáng)度，觀察tau-1在鐵離子作用前后表達(dá)情況的變化。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間差異以方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著性。 結(jié)果：細(xì)胞外鐵離子對細(xì)胞存活有明顯抑制作用，MTT法的平均OD值與細(xì)胞存活率隨鐵離子濃度與作用時間的增大而減少，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著差異，呈濃度與時間依賴性。流式細(xì)胞術(shù)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞周期主要位于G1期，實(shí)驗(yàn)組G2期

4、較對照組高。電子顯微鏡下顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞主要出現(xiàn)壞死改變，胞漿內(nèi)出現(xiàn)較大的空泡，次級溶酶體增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)特征性凋亡改變。SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)少量的去磷酸化tau蛋白，主要集中在胞漿，突起中。較低濃度的鐵溶液(如0.2～0.8 mmol/L)短時間(5～15mins)作用下tau-1細(xì)胞免疫熒光法的平均熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，高濃度鐵溶液(2mmol/L,5mins)作用下tau-1平均熒光強(qiáng)度降低。 結(jié)論：鐵離子對SH-SY5Y細(xì)