Aβ和人參皂苷對神經(jīng)干細胞分化過程中tau蛋白磷酸化水平的影響.pdf

1、背景和目的 神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)是具有增殖和自我更新能力的細胞，在一定條件下可誘導分化成神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞。近十年的研究表明，胚胎和成人腦組織中均存在神經(jīng)干細胞，這為神經(jīng)干細胞的移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論依據(jù)。當神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，神經(jīng)干細胞可分化為有功能細胞進行補充，但是在一些神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如(Alzheimer disease，AD)中，這種補救機制似乎并未發(fā)生，

2、神經(jīng)細胞呈持續(xù)丟失狀態(tài)。我們推測，這可能是由于AD病中腦內(nèi)既有病變?nèi)绺逜β的微環(huán)境不利于神經(jīng)干細胞的分化發(fā)育，或者在病理微環(huán)境下分化的神經(jīng)細胞不能形成正常的結(jié)構和功能。 微管相關蛋白tau蛋白與神經(jīng)細胞的結(jié)構和功能發(fā)揮關系密切。微管在維持神經(jīng)元正常的細胞形態(tài)和細胞內(nèi)部的細胞器、蛋白質(zhì)的運輸、信息傳遞等方面起著重要的作用，tau蛋白是微管結(jié)構維持和功能活動所必需的組分。tau蛋白在神經(jīng)元中大量表達，主要定位于軸突，其主要作用是維持

3、已形成的微管的穩(wěn)定性，有助于微管的延長。 本實驗室前期研究骨髓間質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞過程中，發(fā)現(xiàn)骨髓間質(zhì)干細胞在形態(tài)上逐漸向神經(jīng)細胞樣改變后tau蛋白表達及其含量隨神經(jīng)細胞形態(tài)的形成而逐漸增加，提示由骨髓間質(zhì)干細胞誘導分化的神經(jīng)細胞發(fā)育過程中，需要大量的tau蛋白來促進微管的形成。也有研究表明，在神經(jīng)干細胞定向分化過程中tau蛋白“從無到有”，Tau蛋白緊隨微管的延伸，增加微管的穩(wěn)定性，幫助微管在突起中伸展，確保突起正常生長，

4、從而促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元形態(tài)的轉(zhuǎn)化。 正常Tau蛋白是一種磷酸蛋白，過度磷酸化可負調(diào)節(jié)Tau蛋白與微管結(jié)合的能力。正常磷酸化狀態(tài)的tau蛋白有助于其功能的發(fā)揮，Tau發(fā)生高度磷酸化后，其促微管組裝和維持微管結(jié)構的活性明顯下降，導致神經(jīng)原纖維的形態(tài)異常和軸漿轉(zhuǎn)運障礙。但在神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)細胞過程中，關于Tau蛋白磷酸化的情況及是受調(diào)節(jié)程度還未見報道。本實驗選取tau蛋白有一定代表性的兩個磷酸化位點Tau[pS396]Tau[

5、pS262]和磷酸化調(diào)節(jié)蛋白激酶GSK-3β，通過免疫細胞化學和蛋白印跡方法，在神經(jīng)干細胞分化7天時檢測的這兩個位點的磷酸化情況，并用Aβ25-35和人參皂苷Rb1進行干預，探索新生神經(jīng)細胞的Tau蛋白磷酸化水平的調(diào)節(jié)途徑，從而為AD等疾病的發(fā)病機制和治療途徑提供理論和實驗依據(jù)。 方法 無菌條件下自新生大鼠海馬齒狀回分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，將第三或第四代處于增值期的神經(jīng)干細胞，體外培養(yǎng)并加血清及撤除有絲分裂原誘導分化，7天后

6、分三組處理(1)正常組：不另加其它處理因素，繼續(xù)培養(yǎng)36小時：(2)Aβ25-35處理組：繼續(xù)培養(yǎng)24小時后加入凝聚態(tài)Aβ25-35(20μmol/L)作用于細胞12h：(3)人參皂苷Rb1預處理組：先加入人參皂苷Rb1(10μmol/L預處理24h,再加入凝聚態(tài)Aβ25-35(20μmol/L)作用于細胞12h。用免疫細胞化學和western-blot檢測Tau[pS396]Tau[pS262]及GSK-3β[pTyr279，216]

7、蛋白表達情況，數(shù)據(jù)記錄采用X±S表示，采用SPSS12．0軟件分析。組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 1．Tau蛋白磷酸化狀態(tài)的免疫細胞化學染色結(jié)果：對各組細胞爬片進行免疫細胞化學染色，在正常組神經(jīng)干細胞分化過程中可檢測到Tau[pS396]Tau[pS262]陽性表達的細胞，陽性率分別為12．6﹪和lO．6﹪。經(jīng)Aβ25-35處理后，該組細胞的Tau[pS396]Tau[ps262]的

8、表達明顯增高，主要表現(xiàn)為細胞胞漿和軸突染色明顯增濃，陽性細胞數(shù)增多，陽性細胞率較正常組顯著升高(P<0.01)。但經(jīng)人參皂苷Rb1預處理后再用Aβ25-35處理，該組的陽性細胞率雖然比正常組表達升高(P<0.01)，但增高水平低于Aβ25-35組(P<0.01)，陽性細胞主要表現(xiàn)為胞漿和軸突著色稍濃。 2．Tau蛋白磷酸化狀態(tài)的蛋白免疫印跡結(jié)果：提取各組的細胞蛋白做蛋白免疫印跡，Ap處理組條帶較正常組和人參皂螢Rb1預處理組點濃

9、度高，而人參皂苷Rb1預處理組條帶濃度較正常組高，統(tǒng)計結(jié)果顯示，Tau[pS396],Tau[pS262]在各組之間均有顯著性差異，各組兩兩比較也有統(tǒng)計學意義。 3．GSK-3β的蛋白免疫印跡結(jié)果：各組GSK-3β[pT279/216]蛋白條帶濃度以Ap處理組最高，而人參皂苷Rbl預處理組條帶濃度較正常組高，與各組tau蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)一定相關性。 結(jié)論 1．神經(jīng)干細胞分化過程中Tau蛋白具有一定程度的磷酸化水平。