siRNA-PGC-1α基因?qū)PP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、【背景】
　　帕金森病(Parkinson disease,PD)是一種中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,線粒體功能障礙在PD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,在與PD發(fā)病相關(guān)的眾多環(huán)境與遺傳因素中,線粒體功能障礙是一個(gè)共同的作用點(diǎn)。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor 1 alpha,PGC-1α)是一個(gè)多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,廣泛參與線粒體生物

2、合成、糖脂代謝以及抗氧化通路的調(diào)節(jié)。近年來(lái)普遍認(rèn)為PGC-1α有可能成為早期干預(yù)PD的重要治療靶點(diǎn),但在PD的發(fā)病機(jī)制中PGC-1α信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)線粒體生物活性的影響尚不明確。目前雖然已對(duì)PGC-1α有了大量研究,但目前尚未發(fā)現(xiàn)它的特異性抑制劑。RNAi技術(shù),即RNA干擾,能利用特定序列的小雙鏈RNA高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá),促使mRNA降解,誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型,廣泛用于基因分子生物學(xué)研究。
　　【目的】

3、　　1、通過(guò)腺病毒介導(dǎo)siRNA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞PGC-1α基因沉默,并篩選出最有效的干擾序列。
　　2、探討siRNA-PGC-1α對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞模型的生長(zhǎng)及線粒體功能、能量的影響。
　　【方法】
　　1、通過(guò)免疫組化鑒定SH-SY5Y細(xì)胞酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá)情況。
　　2、用攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞,培養(yǎng)24h后在熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞的數(shù)目

4、判斷轉(zhuǎn)染率,確定合適的感染倍數(shù)(MOI)。
　　3、用腺病毒分別介導(dǎo)四種針對(duì)PGC-1α基因的干擾序列PGC-1、PGC-2、PGC-3、PGC-4和一個(gè)陰性對(duì)照序列Ad,感染SH-SY5Y細(xì)胞;再用real-time PCR和Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞PGC-1α的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
　　4、用MTT法檢測(cè)不同濃度MPP+(0、250、500、1000、1500、2000umol/L)對(duì)SH-SY5Y細(xì)

5、胞存活率的影響,以制備PD細(xì)胞模型。
　　5、用最有效的干擾序列PGC-1感染PD細(xì)胞模型,分組為PBS組、PBS+MPP+組、Ad+PBS組、Ad+MPP+、PGC-1+PBS、PGC-1+MPP+,用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況;流式細(xì)胞儀分析線粒體膜電位來(lái)間接反應(yīng)線粒體整體的功能狀態(tài);通過(guò)熒光素酶發(fā)光法檢測(cè)ATP水平了解線粒體產(chǎn)能能力;利用熒光分析法檢測(cè)H2O2水平來(lái)反應(yīng)線粒體產(chǎn)生氧化物情況。
　　【結(jié)果】
　　

6、1、免疫組化鑒定顯示,實(shí)驗(yàn)所用SH-SY5Y細(xì)胞TH表達(dá)陽(yáng)性。
　　2、MOI為50時(shí),腺病毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染率,且對(duì)細(xì)胞損傷較少。
　　3、通過(guò)real-time PCR和Western-blot檢測(cè):與陰性對(duì)照Ad組相比,PGC-1、PGC-2、PGC-3、PGC-4各組PGC-1α的mRNA和蛋白的表達(dá)均下調(diào)(P<0.01);其中PGC-1組PGC-1α的mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為30.74％、1

7、5.56%,下調(diào)最為顯著。
　　4、MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn),通過(guò)MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯下降,且存在劑量依賴關(guān)系,在MPP+(1000μΜ/L)時(shí),細(xì)胞存活率比對(duì)照組降低35.23%(P<0.01),該濃度可作為細(xì)胞造模濃度。
　　5、沉默PGC-1α基因可顯著引起正常SH-SY5Y細(xì)胞和PD模型細(xì)胞的損傷、線粒體膜電位降低、減少ATP的產(chǎn)生以及增加H2O2生成。
　　【結(jié)論】
　　1、腺病毒對(duì)SH-SY