溴苯腈對SH-SY5Y細(xì)胞毒性及NF-κB、MAPKs通路的影響.pdf

1、第一部分溴苯腈對SH-SY5Y細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　目的:探討溴苯腈對SH-SY5Y細(xì)胞增殖、凋亡的影響
　　方法:用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測溴苯腈細(xì)胞毒性,根據(jù)細(xì)胞存活率篩選合適劑量濃度;以選定的溴苯腈劑量組,處理時(shí)間為24h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目變化;用Hoechst33342/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測溴苯腈對細(xì)胞凋亡形態(tài)及凋亡率的影響;用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測溴苯腈分別處理24h和48h后對細(xì)胞抑制率及I

2、C50的影響,用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定溴苯腈對SH-SY5Y細(xì)胞生長曲線及倍增時(shí)間的影響。
　　結(jié)果:MTT法測定細(xì)胞存活率篩選的合適劑量濃度為0、10、50、100μmol/L。按確定的劑量組處理SH-SY5Y細(xì)胞24h,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),陰性對照組細(xì)胞呈多角形,胞體大,排列緊密,縫隙小;高劑量組細(xì)胞呈長梭形狀改變,胞體變小,稀疏。溴苯腈對細(xì)胞凋亡形態(tài)及凋亡率的影響:陰性對照組細(xì)胞核染成淡藍(lán)色,形態(tài)飽滿,核膜完整,核質(zhì)著色

3、深,密度均勻一致;10、50μmol/L處理組與陰性對照組比較未見異常;100μmol/L可見少量核皺縮變小,染色質(zhì)濃縮邊集,核形態(tài)多樣,熒光增強(qiáng),可見少量形似塊狀的凋亡細(xì)胞碎片的特征。與陰性對照組比較,各劑量組溴苯腈對SH-SY5Y細(xì)胞早期和晚期凋亡率均無明顯影響,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。檢測細(xì)胞增殖活力發(fā)現(xiàn),與陰性對照組比較,染毒24h和48h后,50、100μmol/L溴苯腈組的細(xì)胞增殖抑制率均增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

4、P<0.05);與24h各組比,處理48h后50、100μmol/L組的細(xì)胞增殖抑制率顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度溴苯腈處理SH-SY5Y細(xì)胞24h和48h后,其IC50分別是267.00±29.54μmol/L,95％CI(193.06~340.40μmol/L)和54.33±8.08μmol/L,95%CI(34.25~74.41μmol/L),IC50隨著時(shí)間的延長而減小,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

5、生長曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞數(shù)目開始增加的時(shí)間后延,細(xì)胞倍增時(shí)間增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100μmol/L組在0~96h生長曲線中細(xì)胞數(shù)目無明顯變化(P>0.05);各組細(xì)胞數(shù)目在溴苯腈處理24h開始出現(xiàn)差異,組間差異隨著培養(yǎng)時(shí)間延長更加明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)條件下,根據(jù)細(xì)胞數(shù)目形態(tài)、增殖抑制率、生長曲線結(jié)果均提示,溴苯腈可抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖;細(xì)胞

6、凋亡形態(tài)及凋亡率未觀察到明顯變化。
　　第二部分NF-κB、MAPKs等在溴苯腈致SH-SY5Y細(xì)胞增殖抑制中表達(dá)及作用初探
　　目的:探討溴苯腈作用SH-SY5Y細(xì)胞后對NF-κB、MAPKs通路的影響。
　　方法:以0、10、50、100μmol/L溴苯腈分別處理SH-SY5Y細(xì)胞24h,蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測NF-κB、IκBα、Bcl-2、XIAP、p-p38、p-JNK的表達(dá);免疫細(xì)胞

7、化學(xué)法(immunocytochemistry)檢測NF-κB、Cytc-c的表達(dá)。
　　結(jié)果:溴苯腈處理SH-SY5Y細(xì)胞24h,與陰性對照組比較,隨著染毒劑量的增加,NF-κB、p-p38、Cytc-c表達(dá)增加,IκBα、Bcl-2表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);XIAP、p-JNK表達(dá)與陰性對照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)條件下,觀察到溴苯腈處理后,有NF-κB、p38的