細(xì)胞自噬及其信號通路在memantine對于轉(zhuǎn)染APPswe的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用的研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又稱老年性癡呆，是一種主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變等的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的病因及發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認(rèn)為是由遺傳和環(huán)境等多種因素引起的。AD的神經(jīng)病理學(xué)特征主要包括神經(jīng)元的大量丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生、細(xì)胞外異常淀粉樣β（β-amyloid protein，Aβ）蛋白聚集形成的老年斑(senile plaque，SP)沉積和由細(xì)胞內(nèi)超磷酸化tau蛋白組

2、成的神經(jīng)纖維纏結(jié)等。其中，Aβ蛋白的雜亂聚集是阿爾茲海默癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而Aβ前體蛋白(APP)基因在DNA水平的變異是造成Aβ增加的主要原因。隨著人口老齡化的進(jìn)程，AD的發(fā)病率逐年上升，AD的防治是近年來研究的熱點，而針對其有效的治療藥物依然缺乏。
　　N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體對于神經(jīng)元突觸的可塑性的維持具有重要的作用，而研究表明Aβ寡聚物的作用依賴于NMDA受體的活

3、化。鹽酸美金剛(Memantine)是金剛烷(adamantine)的一種衍生物，作為NMDA受體的非特異性阻斷劑，已被批準(zhǔn)用于中度到重度AD的治療。多項研究表明memantine可通過非特異性阻斷突觸后NMDA受體的作用來抑制依賴NMDA受體的Aβ肽誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。也有研究顯示在AD的動物和細(xì)胞模型中，美金剛還可通過不依賴于NMDA受體功能的抗細(xì)胞凋亡作用來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用。所以美金剛對AD起保護(hù)作用的機制尚不十分明確。
　　

4、自噬在AD中發(fā)揮的作用一直存在著爭議，有的研究認(rèn)為在AD的神經(jīng)突中自噬的誘導(dǎo)增強和轉(zhuǎn)運回神經(jīng)元胞體的過程受阻，會導(dǎo)致自噬小體在受損神經(jīng)突中大量積累。APP、β分泌酶和γ分泌酶在自噬小體中均有明顯表達(dá)，反而增加了二者的相互作用時間，所以自噬成為新的Aβ產(chǎn)生途徑，促進(jìn)AD的發(fā)生和進(jìn)展。也有研究顯示通過自噬增強劑增強自噬作用，可減輕AD模型小鼠的認(rèn)知功能障礙，并降低Aβ水平。細(xì)胞自噬上游調(diào)控通路主要有兩種，一種是mTOR依賴的信號通路，即PI

5、3K-Akt-mTOR信號通路;另一種為不依賴mTOR的信號通路，主要是由JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物調(diào)控的信號通路。
　　鑒于上述自噬在AD中發(fā)揮的作用存在爭議以及memantine對AD治療的作用機制尚不明確的現(xiàn)狀。本課題建立過表達(dá)人瑞端突變型APP659蛋白的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞作為AD的細(xì)胞模型，明確在該AD模型中自噬對細(xì)胞具有保護(hù)作用還是具有促進(jìn)其凋亡作用，同時探討美金剛對AD細(xì)胞模型細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞

6、自噬的作用以及通過何種信號通路來調(diào)控自噬作用，以此來揭示美金剛對細(xì)胞的保護(hù)作用機制，旨在為阿爾茨海默病的進(jìn)一步預(yù)防、治療及預(yù)后提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　本實驗分為三部分，首先在體外培養(yǎng)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，瞬時轉(zhuǎn)染建立過表達(dá)瑞典突變型APP695基因的AD細(xì)胞模型并鑒定。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后加入不同終濃度的memantine（1μM、5μM、10μM）處理后，MTT檢測細(xì)胞的存活率。然后，使用memantine和自

7、噬增強劑雷帕霉素共同處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況，吖啶橙染色于激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬小體的生成情況，Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg-5的表達(dá)情況。最后，用memantine處理AD模型細(xì)胞后Western blot檢測自噬信號通路蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Beclin-1及JNK1的表達(dá)情況，免疫熒光

8、單/雙染觀察細(xì)胞中Bcl-2和Beclin-1的定位。
　　研究結(jié)果:
　　一、 AD細(xì)胞模型的建立與鑒定
　　復(fù)蘇神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y，使用APP695重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實驗分為未轉(zhuǎn)染組(Control)、轉(zhuǎn)染試劑組(Mock)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(NC)以及目的載體轉(zhuǎn)染組(APP695)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，Real-time PCR檢測各組細(xì)胞APP695的mRNA檢測，48 h后Western

9、 blot檢測各組細(xì)胞APP695蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示:與Control組相比，APP695組APP695的mRNA及蛋白的水平均顯著提高(P＜0.01)，而Mock組與NC組APP695蛋白的表達(dá)與Control組相比并無明顯區(qū)別(P＞0.05)。
　　二、 MTT法檢測memantine對AD細(xì)胞模型細(xì)胞生存率的影響
　　用不同濃度的memantine(1μM、5μM、10μM)處理轉(zhuǎn)染APP695質(zhì)粒以及對

10、照組的細(xì)胞，24 h、48h后MTT實驗檢測各組細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示:與對照組相比，APP695質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活率明顯下降(P＜0.05)，而經(jīng)memantine處理后細(xì)胞的存活率明顯升高(P＜0.05)，且具有劑量依賴性。并確定5μM為memantine最適使用濃度。
　　三、Memantine對AD模型細(xì)胞自噬作用的影響
　　用藥物memantine及自噬增強劑雷帕霉素處理轉(zhuǎn)染APP695的細(xì)胞同時設(shè)對照組，實驗分

11、為A:NC組，B:NC+Memantine組，C:APP695組，D:APP695+memantine組，E:APP695+memantine+自噬增強劑組。吖啶橙染色，檢測細(xì)胞各組細(xì)自噬小體水平。Western blot檢測各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Atg-5的表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照組相比，APP695組吖啶橙染色自噬現(xiàn)象明顯，自噬小體增多，且Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/L

12、C3-Ⅰ的比值、Beclin-1、Atg-5均顯著提高(P＜0.01);加入memantine后的APP695+memantine組自噬情況及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平又恢復(fù)到與對照組無顯著差異的水平（P＞0.05）;而加入自噬增強劑雷帕霉素的APP695+memantine+自噬增強劑組自噬情況及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平又顯著提高(P＜0.01)。
　　四、Memantine對AD模型抗細(xì)胞凋亡作用與自噬的關(guān)系
　　用藥物meman

13、tine及自噬增強劑雷帕霉素處理轉(zhuǎn)染APP695的細(xì)胞同時設(shè)對照組，實驗分為A: NC組，B:NC+Memantine組，C:APP695組，D:APP695+memantine組， E:APP695+memantine+自噬增強劑組。AnnexinV-APC/7-AAD染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測。同時Western blot檢測各組細(xì)胞中凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示:與對照組相比，NC+memantine組僅有少量的

14、細(xì)胞凋亡（P＞0.05），APP695組的凋亡率顯著提高(P＜0.01)。Memantine處理后APP695轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率下降(P＜0.01);經(jīng)memantine及自噬增強劑共同處理后，細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P＜0.01），接近于APP695無藥物處理組。Western blot結(jié)果顯示APP695組與memantine及自噬增強劑共同處理組Caspase-3的表達(dá)量最高。而與該兩者相比，memantine處理后Caspase-3

15、的表達(dá)明顯降低。
　　五、 Memantine影響AD模型細(xì)胞自噬的機制
　　藥物memantine處理轉(zhuǎn)染APP695質(zhì)粒組細(xì)胞及對照組細(xì)胞，實驗分為A: NC組，B:NC+memantine組，C:APP695組，D: APP695+ memantine組。Western blot檢測各組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、Bcl-2、Beclin-1、JNK1蛋白的表達(dá)。免疫熒光單染和雙染檢測Bcl-2和Be

16、clin-1的定位，并用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果顯示:與NC組細(xì)胞相比，APP695組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR的蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，memantine的加入可以明顯上調(diào)這3種蛋白的表達(dá);同時APP695組細(xì)胞中提高自噬作用的JNK1、Beclin-1蛋白的表達(dá)提高、而抑制自噬的Bcl-2的表達(dá)降低(P＜0.01)，免疫熒光雙染也顯示Bcl-2與Beclin-1共同定位明顯降低。而上述這三種蛋白的表達(dá)量

17、在memantine處理AD模型細(xì)胞后均發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。以上實驗結(jié)果說明memantine通過上調(diào)細(xì)胞中自噬信號通路PI3K-Akt-mTOR和下調(diào)JNK1活化的Bcl-2/Beclin-1復(fù)合物來調(diào)控細(xì)胞的自噬功能。
　　結(jié)論:
　　1、Memantine呈濃度依賴性的提高AD模型細(xì)胞的存活率，5μM為memantine對AD模型細(xì)胞的最佳使用濃度。
　　2、在AD模型細(xì)胞中細(xì)胞的自噬作用是促進(jìn)凋亡的。
　　3、M

18、emantine能抑制AD模型細(xì)胞的自噬作用。
　　4、Memantine可抑制AD模型細(xì)胞凋亡，其抗凋亡能力與降低Caspase-3的表達(dá)水平有關(guān)。而且memantine的抗凋亡作用要通過抑制細(xì)胞的自噬作用來實現(xiàn)。
　　5、AD模型細(xì)胞中PI3K-Akt-mTOR信號通路被抑制，JNK1促進(jìn)了Bcl-2與Beclin-1分離。
　　6、Memantine能通過活化PI3K-Akt-mTOR信號通路來抑制AD模型細(xì)胞的