CBS基因干擾和OGD-R后SH-SY5Y細(xì)胞自噬和凋亡情況及相關(guān)信號(hào)通路研究.pdf

1、目的：
　　利用siRNA干擾技術(shù)干擾胱硫醚β-合成酶(cystathionineβ-synthase，CBS)基因并構(gòu)建細(xì)胞氧糖剝奪再灌注(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)模型，探討OGD/R和CBS基因干擾后SH-SY5Y細(xì)胞自噬和凋亡情況及相關(guān)信號(hào)通路變化。
　　方法：
　　構(gòu)建OGD/R模型，體外模擬缺血再灌注過(guò)程，根據(jù)氧糖剝奪和再灌注時(shí)間不同共設(shè)9組，

2、分別為正常對(duì)照組，氧糖剝奪4h/再灌注12h組（4h/12h組），氧糖剝奪4h/再灌注24h組（4h/24h組），氧糖剝奪8h/再灌注12h組（8h/12h組），氧糖剝奪8h/再灌注24h組（8h/24h組），氧糖剝奪12h/再灌注12h組（12h/12h組），氧糖剝奪12h/再灌注24h組（12h/24h組），氧糖剝奪24h/再灌注12h組（24h/12h組），氧糖剝奪24h/再灌注24h組（24h/24h組）。利用透射電鏡(tran

3、smission electron microscopy，TEM)觀察各組細(xì)胞OGD/R后細(xì)胞內(nèi)自噬小體形成情況；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將靶向CBS基因的siRNA轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)構(gòu)建OGD/R模型，氧糖剝奪4h/再灌注24h。將細(xì)胞分為3個(gè)組，分別為CBS干擾組，OGD/R組和CBS干擾+OGD/R組。CBS干擾組以陰性對(duì)照（與干擾組siRNA有相同的堿基組成但與靶mRNA無(wú)同源性的一段核苷酸序列）作為對(duì)照，OGD/R組以正常細(xì)胞

4、作為對(duì)照，CBS干擾+OGD/R組以陰性對(duì)照+OGD/R組作為對(duì)照組。為觀察轉(zhuǎn)染試劑對(duì)正常細(xì)胞的毒性作用，特增加正常對(duì)照組作為參照。以上各組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔并進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)；蛋白印跡法鑒定 CBS基因干擾效率，并檢測(cè)各組自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1和信號(hào)通路中 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋白表達(dá)水平，以及凋亡信號(hào)通路中NF-κBp65、COX-2蛋白表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。

5、>　　結(jié)果：
　　1.透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬小體：除正常對(duì)照組和氧糖剝奪4h/再灌注12h組未觀察到自噬小體外，其余各組均在胞質(zhì)內(nèi)觀察到了較多自噬小體；2. CBS基因干擾效率：蛋白印記法檢測(cè)CBS蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，干擾組與陰性對(duì)照組比較 CBS蛋白表達(dá)量明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陰性對(duì)照組與正常對(duì)照組比較 CBS蛋白表達(dá)水平并無(wú)明顯變化（P>0.05）。3.自噬相關(guān)蛋白及相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)：3.1 CBS

6、干擾組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平與陰性對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。3.2 OGD/R組與正常對(duì)照組比較，OGD/R組 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Beclin-1蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05），p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），NF-κBp65、COX-2蛋

7、白表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3.3 CBS干擾+OGD/R組與陰性對(duì)照+OGD/R組比較，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，Beclin-1，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR均無(wú)顯著差異（P>0.05）。4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果：4.1 CBS干擾組細(xì)胞凋亡率與陰性對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。4.2 OGD/R組與正常對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0