尿酸調(diào)節(jié)Nrf2信號(hào)通路減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分尿酸增加谷胱甘肽合成減輕6-OHDA對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用
　　目的:探討尿酸(uric acid, UA)對(duì)6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法:采用6-OHDA制作SH-SY5Y細(xì)胞損傷的帕金森病細(xì)胞模型,分為對(duì)照(DMEM)組、6-OHDA(50μmol/L)組、尿酸組(200μmol/L)以及6-OHDA(50μmol/L)+尿酸組(200μmol/L

2、)。預(yù)給尿酸0.5h后6-OHDA作用6h、12h、14h、18h、24h后MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性;作用12h倒置顯微鏡下觀測(cè)細(xì)胞形態(tài);比色法檢測(cè)谷胱甘肽含量;預(yù)給尿酸0.5h后6-OHDA作用12h后Western blot和RT-PCR法分別測(cè)定γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(γ-GCLC)和γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基(γ-GCLM)蛋白和mRNA水平的表達(dá)量。
　　結(jié)果:200μmol/L尿酸對(duì)50μmol/L6-

3、OHDA作用12h、14h、18h、24h的SH-SY5Y細(xì)胞活性下降有顯著的改善(78.10±2.36％vs57.44±12.02％,80.52±3.16％vs50.15±2.32％,70.82±1.81％vs39.22±0.78％,42.84±4.73％vs27.99±4.23％,P<0.01, P<0.001, P<0.001,P<0.001);作用12h后尿酸處理組細(xì)胞形態(tài)明顯改善;谷胱甘肽含量下降有顯著的改善(9.51±0.3

4、7μmol/L vs3.88±0.78μmol/L, P<0.01);200μmol/L尿酸+50μmol/L6-OHDA組與50μmol/L6-OHDA組相比,γ-GCLC蛋白表達(dá)水平顯著升高(139.85±11.62％vs49.20±7.09％,P<0.01);γ-GCLM.表達(dá)水平明顯下降(95.36±18.98％vs160.05±8.59％,P<0.05)。mRNA水平上γ-GCLC轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(110.99±14.41％v

5、s49.19±6.87％,P<0.001);γ-GCLM.轉(zhuǎn)錄水平明顯下降(102.70±10.43％vs190.05±8.59％,P<0.05)。
　　結(jié)論:尿酸對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用,與增加谷胱甘肽合成有關(guān)。
　　第二部分尿酸對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用
　　目的:探討尿酸增加谷胱甘肽生物合成的分子機(jī)制。
　　方法:采用6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞制造帕金森病細(xì)胞模型,分

6、為對(duì)照(DMEM)組、6-OHDA(50μmol/L)組、尿酸組(200μmol/L)以及6-OHDA(50μmol/L)+尿酸(200μmol/L)組,預(yù)先給予尿酸0.5h后,6-OHDA作用6h用共聚焦法觀察Nrf2在胞漿、胞核的分布情況,運(yùn)用胞漿胞核蛋白提取法后Western blot測(cè)定不同組別SH-SY5Y細(xì)胞上Nrf2表達(dá)情況;用基因轉(zhuǎn)染siRNA敲減Nrf2方法后再運(yùn)用比色法測(cè)定敲減組與未敲減組不同組別谷胱甘肽含量及細(xì)胞活

7、力。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比,50μmol/L6-OHDA作用于SH-SY5Y細(xì)胞6h后Nrf2的分布無(wú)明顯變化,胞漿胞核蛋白也無(wú)明顯改變;與單獨(dú)6-OHDA組相比,200μmol/L尿酸作用6h后共聚焦示Nrf2由胞漿明顯轉(zhuǎn)入胞核,提取胞漿胞核蛋白后尿酸處理組Nrf2核蛋白含量明顯增加(196.33±35.21％vs93.11±29.25％,P<0.05);單獨(dú)尿酸與對(duì)照組比,Nrf2核蛋白含量明顯增加(231.36±55.19