ANKIB1對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及CnAα4的功能分析.pdf

1、背景：
　　神經(jīng)退行性疾病的治療在臨床上缺少有效的方法，因此需要尋找新的與神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的分子靶點(diǎn)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CN)是目前唯一受Ca2+和鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)調(diào)控的蛋白磷酸酶，由催化亞基CnA和調(diào)節(jié)亞基CnB組成，能夠活化活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT)，與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。含錨蛋白重復(fù)序列和IBR結(jié)構(gòu)域蛋白1

2、（ankyrin repeat and IBR domaincontaining1，ANKIB1）含有一個(gè)CN的結(jié)合位點(diǎn)，其與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系尚缺乏研究。CnAα4是一種新的人CnA1轉(zhuǎn)錄本，其編碼蛋白的功能未見報(bào)道。
　　目的：
　　1、探索ANKIB1對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制;
　　2、揭示CnAα4的功能。
　　方法：
　　1、Western印跡檢測ANKIB1對SH-SY5Y細(xì)胞凋

3、亡的影響
　　將pCMV-Myc-ANKIB1轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，向培養(yǎng)液中加入百草枯，western印跡檢測細(xì)胞裂解液中活化的caspase3、失活的PARP和p-IκB的水平。
　　2、ANKIB1與CaM的關(guān)系
　　首先用pull down和Co-IP證明ANKIB1與CaM相互作用，然后調(diào)整反應(yīng)體系中游離的Ca2+濃度，研究Ca2+對二者相互作用的影響。
　　將pFLAG-CMV-CaM和pCMV-

4、Myc-ANKIB1共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后對qPCR和western印跡分析CaM對ANKIB1基因表達(dá)的影響。蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究CaM對ANKIB1蛋白穩(wěn)定性的影響。
　　3、雙熒光素酶報(bào)告基因分析ANKIB1對NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的影響
　　將pCMV-Myc-ANKIB1轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，24 h后向培養(yǎng)液中加入離子霉素(2μM)或者環(huán)孢菌素A（2μM）處理6h，然后雙熒光素酶報(bào)告基因分析ANKI

5、B1對NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。
　　4、CnAα4功能鑒定
　　Pull down檢測CnAα4與CaM的結(jié)合能力，免疫熒光分析CnAα4對NFAT核轉(zhuǎn)位的影響，雙熒光素酶報(bào)告基因分析CnAα4對NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1、轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-ANKIB1的SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)百草枯處理之后活化的caspase3和失活的PARP水平較對照組均有所降低;
　　2、ANKIB1與Ca

6、M相互作用，不同濃度的Ca2+CaM-agarose上結(jié)合的ANKIB1的量有差別，CaM通過增強(qiáng)ANKIB1的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)ANKIB1基因的表達(dá);
　　3、ANKIB1能夠抑制NFAT的轉(zhuǎn)錄因子活性;
　　4、CnAα4具有與CnAα1相似的CaM親和力，能夠促進(jìn)NFATc1的核轉(zhuǎn)位，較CnAα1有更強(qiáng)的激活NFAT轉(zhuǎn)錄因子活性的能力。
　　結(jié)論：
　　1、ANKIB1與CaM相互作用，抑制NFAT的轉(zhuǎn)錄