MicroRNA-1抑制內(nèi)皮素-1表達(dá)機(jī)制的初步研究.pdf

1、本研究通過對(duì)MicroRNA-1和ET-1mRNA時(shí)空表達(dá)譜檢測(cè)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)了MicroRNA-1可能參與調(diào)控ET-1基因表達(dá)的多項(xiàng)線索；利用報(bào)告基因、預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)序列缺失和突變等功能研究方法，證實(shí)了MicroRNA-1能夠通過ET-13'UTR上特定靶序列在轉(zhuǎn)錄后水平抑制內(nèi)源性ET-1基因表達(dá)。我們的研究首次發(fā)MicroRNA對(duì)心血管活性物質(zhì)的調(diào)控作用，為闡明MicroRNA在心血管生理活動(dòng)和疾病中的作用提供了新的依據(jù)。

2、 內(nèi)皮素(endothelin，ET)是1988年Yanagisawa等首先從豬的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離純化的一種由21個(gè)氨基酸組成的心血管活性多肽，主要分布于心血管系統(tǒng)，是目前已知最強(qiáng)烈的血管收縮物質(zhì)之一。在心臟，ET-1參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚、心律失常等生理和病理生理過程。ET-1基因受不同水平的表達(dá)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控對(duì)于ET-1基因表達(dá)具有重要意義，ET-1 mRNA 3’非翻譯區(qū)(3’UTR)存在多個(gè)富含AU的反應(yīng)元件(

3、A-U rich element，ARE)，直接影響mRNA的穩(wěn)定性；本課題組前期在大鼠急性缺血性心律失常模型中，采用針對(duì)ET-1 mRNA的反義寡核苷酸和ET-1 10-23脫氧核酶，均能有效下調(diào)ET-1基因表達(dá)，減少缺血性心律失常的發(fā)生，說明內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制和外源性干預(yù)手段均能夠在轉(zhuǎn)錄后水平影響ET-1基因表達(dá)。MicroRNA是近年來在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性單鏈小分子RNA，長度在19-22核苷酸左右，其序列在物種間高度保守。Mi

4、croRNA通過與靶基因mRNA 3’非翻譯區(qū)(3'UTR)上相應(yīng)靶序列堿基之間不完全或完全的互補(bǔ)結(jié)合，而抑制mRNA的翻譯或?qū)е耺RNA的降解，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮對(duì)靶基因的沉默效應(yīng)。在生物體中已發(fā)現(xiàn)的microRNA序列多達(dá)600余種，參與了包括生物體發(fā)育、腫瘤發(fā)生、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及病原體感染等多種生理和病理生理過程。在心血管系統(tǒng)，已有報(bào)道MicroRNA參與了心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等多種生理和病理生理過程，尤其是一些心

5、臟組織特異性表達(dá)的MicroRNA與心臟特殊的生理結(jié)構(gòu)和病理過程密切相關(guān)。 在本研究中，我們擬通過檢測(cè)分析MicroRNA-1和ET-1 mRNA在組織細(xì)胞的表達(dá)分布以及在C2C12成肌細(xì)胞分化過程中表達(dá)變化及其相關(guān)性，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，尋找和明確MicroRNA-1參與ET-1基因表達(dá)調(diào)控的線索；利用報(bào)告基因系統(tǒng)和靶序列缺失突變等MicroRNA功能研究方法，確認(rèn)MicroRNA-1對(duì)內(nèi)源性ET-1基因表達(dá)的調(diào)控作用，并對(duì)這

6、種調(diào)控作用的機(jī)制進(jìn)行初步研究，為闡明MicroRNA在心臟發(fā)育、心肌肥厚和心律失常等心臟生理和病理生理過程中的功能作用提供新的理論依據(jù)，為心血管疾病防治的提供新的思路和治療策略。 材料和方法： (1)細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：Hela和293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(Biosource)和100U/ml青鏈霉素(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長滿10cm培養(yǎng)板底面積80％-90％，用0.25％-EDTA胰酶(Gibco

7、)消化細(xì)胞后，以每孔1×10<'5>個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用脂質(zhì)體 lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒載體。 (2) C2C12小鼠成肌細(xì)胞的培養(yǎng)和分化：C2C12培養(yǎng)于含10％胎牛血清和100U/ml青鏈霉素的DMEM生長培養(yǎng)基中，待細(xì)胞長滿10cm培養(yǎng)板底面積 70％-80％，用0.25％-EDTA胰酶消化后，以每孔2×10<'5>個(gè)

8、細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日將生長培養(yǎng)基更換為含2％熱滅活馬血清的DMEM分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。分別收取分化第一、四、六天細(xì)胞樣品抽提 RNA，檢測(cè)分析MicroRNA-1和ET-1等基因mRNA表達(dá)變化。 (3)SYBR Green定量PCR檢測(cè)成熟MicroRNA和ET-1等基因mRNA的表達(dá)：以小鼠和人組織細(xì)胞總RNA為模板，分別利用MicroRNA特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄(RT

9、)引物、隨機(jī)引物和OligodT20作為RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到MicroRNA、U6剪接體RNA和ET-1等基因mRNA的cDNA模板；利用SYBR Premix Ex Taq酶(TakaRa)和特異性定量PCR引物對(duì)MicroRNA、U6和ET-1等基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析 (4)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)：利用TargetScan、BiBiserve等MicroRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站和軟件，對(duì)人ET-13’非翻譯區(qū)(3’UTR

10、)上MicroRNA-1作用的靶序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。 (5)載體構(gòu)建和報(bào)告基因檢測(cè)：以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA為模板利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增人ET-13'UTR不同區(qū)域片段，將其亞克隆至pGL3質(zhì)粒(Promega)熒光素酶報(bào)告基因下游，構(gòu)建表達(dá)融合ET-13'UTR的螢光素酶報(bào)告基因的pGL3重組載體；以Hela細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增MicroRNA前體序列，將其亞克隆至pSuper質(zhì)粒H1 RNA啟動(dòng)子下游多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建表達(dá)

11、MicroRNA前體的pSuper重組質(zhì)粒。將上述兩種重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24小時(shí)后，用裂解液裂解細(xì)胞，采用雙螢光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(promega)檢測(cè)樣品螢光素酶相對(duì)表達(dá)量。 (6)MicroRNA靶序列突變：以融合野生型ET-13’UTR的pGL3重組質(zhì)粒為模板，利用靶位點(diǎn)突變引物和高保真酶(TaKaRa)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到靶序列突變的線性化產(chǎn)物，DpNI限制性內(nèi)切酶(Fermentas)消化PCR產(chǎn)物中的質(zhì)粒模板后

12、，在DH5α大腸桿菌中對(duì)線性化產(chǎn)物進(jìn)行同源重組，獲得靶序列突變的環(huán)化pGL3質(zhì)粒，通過測(cè)序證實(shí)靶序列的突變。 (7)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)：Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染MicroRNA表達(dá)載體24小時(shí)后，更換無血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，利用人ET-1ELISA試劑盒(R＆D)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組上清液中ET-1蛋白的相對(duì)含量，以細(xì)胞總蛋白量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 結(jié)果： 小鼠和人部分組織細(xì)胞中Micr

13、oRNA-1和ET-1 mRNA表達(dá)分布和及其相關(guān)性：在小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦、骨骼肌和胃腸平滑肌組織中，MicroRNA-1特異性高表達(dá)于心臟和骨骼肌組織，其他組織MicroRNA-1的相對(duì)表達(dá)水平很低；ET-1 mRNA主要表達(dá)于肺組織，腎臟、胃腸、大腦和心臟表達(dá)相對(duì)較低，骨骼肌和肝臟組織ET-1 mRNA表達(dá)量很低。在人心臟、骨骼組織以及Hela、293T和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中，MicroRNA-1在心臟和骨骼肌中特

14、異性高表達(dá)，在其他三種細(xì)胞中表達(dá)量很低；ET-1 mRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)量最高，在Hela細(xì)胞和心臟組織表達(dá)相對(duì)較低，在骨骼肌和293T細(xì)胞表達(dá)量很低。綜合上述結(jié)果： MicroRNA-1和ET-1 mRNA在組織細(xì)胞表達(dá)分布上存在一定負(fù)相關(guān)性，提示ET-1可能是MicroRNA的靶基因。 結(jié)論： 通過檢測(cè)分析 MicroRNA-1 和 ET-1 mRNA在小鼠和人部分組織細(xì)胞以及C2C12小鼠成肌細(xì)胞分化過程中空間表

15、達(dá)分布和時(shí)序表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)二者在表達(dá)分布和變化趨勢(shì)上存在負(fù)相關(guān)性，提示MicroRNA-1可能參與 ET-1基因表達(dá)調(diào)控；通過生物信息檢索，我們?cè)谌薊T-13’LITR上找到3個(gè)MicroRNA-1潛在作用靶序列；利用螢光報(bào)告基因系統(tǒng)我們發(fā)現(xiàn)MicroRNA-1能夠抑制融合人 ET-13’UTR的螢光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，表明MicroRNA-1對(duì) ET-13’UTR存在抑制性功能作用；結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果，我們利用MicroRNA-

16、1靶序列缺失和突變的方法，證明了MicroRNA-1對(duì)重組螢光素酶報(bào)告基因的抑制效應(yīng)由人 ET-1 3’UTR上第127-151位核苷酸處的MicroRNA-1靶序列所介導(dǎo)。最后，在Hela細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了MicroRNA-1能夠在轉(zhuǎn)錄后水平抑制內(nèi)源性ET-1基因的表達(dá)。我們的研究初步確認(rèn)MicroRNA-1對(duì)ET-1基因表達(dá)的抑制作用，證明了這種調(diào)控效應(yīng)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，明確了介導(dǎo)這一效應(yīng)的MicroRNA-1靶序列，從而進(jìn)一步拓展