內(nèi)皮素-1對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響及其分子機制.pdf

1、目的： 血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一群游走的、骨髓衍生的、與胚胎血管母細(xì)胞相似的細(xì)胞群，是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，能進(jìn)一步增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞。新近研究表明，EPCs不僅參與胚胎期的血管發(fā)育，也存在于成年機體的骨髓及外周血，在成體血管新生中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，EPCs在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色，EPCs數(shù)量減少預(yù)示血管內(nèi)皮修復(fù)能力降低，心血管疾病發(fā)生率增高。EP

2、Cs參與了出生后血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程，EPC與血管新生的關(guān)系展現(xiàn)了其潛在的治療價值，有廣闊的發(fā)展前景。 內(nèi)皮素-1(ET-1)是迄今為止被認(rèn)為是最強的血管收縮肽，。近來一些研究顯示：內(nèi)皮素與多種人類疾病有關(guān)，包括粥樣硬化、高血壓、血管痙攣、以及充血性心衰的心肌肥厚和重塑。在高血壓和冠狀動脈疾病患者，其血漿ET-1濃度是升高的。在粥樣斑塊局部也發(fā)現(xiàn)增高的ET-1濃度，認(rèn)為是由于內(nèi)皮細(xì)胞損傷、剪切力、缺血等因素所至的血管E

3、T-1產(chǎn)生增加。有趣的是，ET-1及內(nèi)皮素系統(tǒng)被認(rèn)為是疾病與健康的雙刃劍，一方面，ET-1通過血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表面的ET受體亞單位A(ETA)介導(dǎo)了細(xì)胞增殖和血管收縮；另一方面，通過內(nèi)皮細(xì)胞表面的ETB受體介導(dǎo)了NO和前列環(huán)素的產(chǎn)生和血管舒張。ET-1對EPCs有何影響，目前未見相關(guān)報導(dǎo)。本實驗的目的就是通過ET-1對體外培養(yǎng)的EPCs進(jìn)行干預(yù)，以明確ET-1對EPCs功能的影響，并進(jìn)一步探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。 方法：

4、 實驗血液樣本來自10位健康男性中青年志愿者。采用密度梯度離心法從外周血獲得單個核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上。M199培養(yǎng)基培養(yǎng)7d的貼壁細(xì)胞供實驗用。貼壁細(xì)胞隨機分成6組，分別為對照組、不同濃度ET-1組、ET-1+P13K激酶抑制劑(Ly294002)組及ET-1+ETB受體阻滯劑量(BQ788)。每組3孔，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正

5、在分化的EPCs，分別采用細(xì)胞計數(shù)法、MTT比色法、改良的Boyden小室、黏附能力測定實驗和體外血管形成試劑盒來觀察EPCs的增殖、遷移、黏附和體外血管形成能力，免疫印跡雜交法(Western blot)測定磷酸化Akt蛋白和磷酸化eNOS蛋白含量。 結(jié)果： 1.EPCs的鑒定分離獲得的單個核細(xì)胞培養(yǎng)7d后形成了梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞。用acLDL-Dil和FITC-UEA-I對細(xì)胞染色后，通過激光共聚焦顯微鏡鑒定，F(xiàn)ITC

6、-UEA-I和Dil-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs，在倒置熒光顯微鏡下(×200)計數(shù)15個隨機選擇視野的EPCs。 2.ET-1對外周血EPCs數(shù)量的影響不同濃度的ET-1與EPCs培養(yǎng)24h顯示ET-1能增加EPCs數(shù)量，并且EPCs數(shù)量隨ET-1濃度增加而增加，Ly294002可顯著抑制其數(shù)量增加效應(yīng)；在1nM組中亦可見EPCs數(shù)量在ET-1作用24h時達(dá)峰。 3.ET-1對外周血EPCs增殖功能的

7、影響采用MTT比色法檢測ET-1對EPCs增殖能力的影響，結(jié)果顯示：ET-1顯著增加EPCs的增殖能力，呈量效關(guān)系；Ly294002、BQ788顯著抑制其促增殖效應(yīng)。 4.ET-1對外周血EPCs遷移功能的影響采用改良的Boyden小室檢測ET-1對EPCs遷移能力的影響，在200倍顯微鏡下計數(shù)遷移的細(xì)胞。ET-1明顯增加EPCs的遷移能力，呈濃度依賴性，Ly294002、BQ788顯著抑制其促遷移能力。 5.ET-1對

8、外周血EPCs黏附功能的影響為了觀察ET-1對外周血EPCs黏附能力的影響，先將不同濃度的ET-1與EPCs培養(yǎng)24h，然后將相同數(shù)量的EPCs重新接種到包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板上培養(yǎng)30min，結(jié)果顯示ET-1明顯增加了EPCs的黏附能力，呈濃度依賴性，Ly294002、BQ788顯著降低其促黏附功能。 6.ET-1對外周血EPCs體外血管形成能力的影響體外血管形成實驗結(jié)果顯示，ET-1明顯促進(jìn)EPCs的體外血管形成能力，

9、Ly294002、BQ788顯著降低其促血管形成功能。 7.ET-1對外周血EPCs中磷酸化Akt蛋白和磷酸化eNOS蛋白表達(dá)的影響ET-1增加了EPCs的磷酸化Akt蛋白和磷酸化eNOS蛋白含量，并呈濃度依賴性，Ly294002、BQ788顯著降低其促上述蛋白表達(dá)的效應(yīng)。 結(jié)論： 1.可以從外周血中的單個核細(xì)胞分離和培養(yǎng)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。 2.ET-1增加外周血EPCs數(shù)量，增強EPCs的增殖能力、遷移能