基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1a對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，EPCs不僅參與血管形成(angiogenesis)，同時(shí)也參與出生后血管生成(vasculogenesis)。近來研究表明內(nèi)皮功能障礙在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色。內(nèi)皮功能障礙的本質(zhì)是內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間動態(tài)平衡的破壞，而EPCs在內(nèi)皮損傷后的修復(fù)中起

2、重要作用。EPCs能修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，保持內(nèi)膜完整性從而抑制局部粥樣硬化斑塊及血栓的形成。然而諸如老齡化、糖尿病、高血壓、高膽固醇及吸煙等冠心病危險(xiǎn)因素對循環(huán)EPCs數(shù)量和活性具有明顯抑制作用。 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(Stromal cell—derived factor-1α，SDF-1α)是趨化因子CXC亞家族中的一員，首先在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中被發(fā)現(xiàn)，又被稱為B細(xì)胞生長因子。其受體(CXCR4)是一個(gè)有7個(gè)

3、跨膜結(jié)構(gòu)域的G蛋白耦聯(lián)受體。近來研究表明SDF-1α／CXCR4之間的特異性作用在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的功能，如遷移、增殖、動員及血管形成的過程中起重要的作用?；谏鲜隼碚?，我們提出假設(shè)：SDF-1α可以影響EPCs的數(shù)量和功能，繼而影響內(nèi)皮修復(fù)能力，維持內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間的動態(tài)平衡，促進(jìn)內(nèi)皮功能的恢復(fù)，進(jìn)而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。目前國內(nèi)外有關(guān)SDF-1α對EPCs數(shù)量和功能的影響，特別是對其機(jī)制的研究尚很少。為此，我們首先觀察了SDF-

4、1α體外干預(yù)對外周血EPCs數(shù)量和功能的影響，隨后進(jìn)一步探討了SDF-1α影響EPCs數(shù)量和功能的可能機(jī)制。以下分三部分對本研究的方法、結(jié)果以及結(jié)論作一簡述。 第一部分　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α對外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能的影響 目的： 觀察SDF-1α體外干預(yù)對外周血EPCs數(shù)量和功能的影響。 方法： 采用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)7d后，收集

5、貼壁細(xì)胞，加入不同濃度SDF-1α(1ngl／mL，10ngl/mL，50ngl/mL和100ngl／mL)干預(yù)，觀察量效關(guān)系。多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDI雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。采用MTT比色法、改良的Boyden小室和粘附能力測定實(shí)驗(yàn)分別觀察EPCs的增殖能力、遷移能力和粘附能力。 結(jié)果： SDF-1α能顯著增加外周血EPC

6、s數(shù)量，并且EPCs數(shù)量隨SDF-1α濃度增高而增加。此外，SDF-1α能明顯增加EPCs的增殖、遷移和粘附能力，并呈濃度依賴性，在100ng/ml組(與對照組比較，增殖能力0.37±0.06 vs 0.23±0.03，遷移能力102.0±22.5 vs 21.5±6.2，粘附能力95.7±21.O vs 32.2±8.3)達(dá)最大增加效應(yīng)。 結(jié)論： SDF-1 α可增加EPCs數(shù)量并增強(qiáng)EPCs功能，且SDF-1α對EP

7、Cs的影響呈一定的量效關(guān)系。 第二部分　基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α影響內(nèi)皮祖細(xì)胞機(jī)制的探討之一----抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡 目的： 研究SDF-la對去血清誘導(dǎo)EPCs凋亡的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 方法： 采用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)4d后，收集貼壁細(xì)胞，多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UYEA-I和DiI-acLDL，雙染色陽性細(xì)胞為正在分化

8、的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。免疫磁珠篩選CD34+細(xì)胞。RT-PCR檢測SDF-1α受體CXCR4 mRNA的表達(dá)：流式細(xì)胞儀測定CXCR4表達(dá)率。培養(yǎng)7d后的EPCs進(jìn)行去血清培養(yǎng)48h以誘導(dǎo)EPCs凋亡，加入不同濃度SDF-1α(1ngl/mL，10ngl/mL，50ngl/mL和100ngl/mL)干預(yù)，或先予以P13K、MAPKs、eNOS抑制劑預(yù)處理1h，然后再用100ngl/mL SDF-1α干預(yù)

9、。FITC-Annexin V/PI流式細(xì)胞儀檢測EPCs凋亡。Caspase-3 Colorimetric Assay Kit檢測caspase-3活性。Western blot檢測EPCs Akt Ser473、ERK1/2、JNK、p38MAPK、eNOS Ser1177磷酸化水平及caspase-3蛋白水平。采用MTT比色法觀察EPCs的增殖能力。 結(jié)果： 培養(yǎng)7天后的EPCs的SDF-1α受體CXCR4 mRN

10、A及蛋白表達(dá)水平明顯高于新分離的CD34+細(xì)胞；SDF-1α能夠顯著抑制去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的EPCs凋亡，并且此抑制作用隨SDF-1α濃度的增加而增加。SDF-1α同樣可以抑制caspase-3的活性及其蛋白表達(dá)。CXCR4受體阻斷劑(AMD3100)，P13K抑制劑(Wortmannin和LY294002)能近乎完全的抵消SDF-1α抑制EPCs凋亡的作用；eNOS抑制劑(L-NAME)可以部分抵消SDF-1α抑制EPCs凋亡的作用；而M

11、APKs抑制劑(PD98059、SB203580及SP600125)則對SDF-1α抑制EPCs凋亡的作用沒有明顯影響。Western blot檢測顯示SDF-1α可以促進(jìn)EPCs Akt、eNOS、ERK1/2、JNK、p38MAPK的磷酸化。此外，SDF-1α干預(yù)后伴隨EPCs增殖能力的增加。 結(jié)論： SDF-1α可以抑制去血清誘導(dǎo)的EPCs凋亡；P13K/Akt/eNOS而非MAPKs信號途徑參與SDF-1α抑制E

12、PCs凋亡的調(diào)控。 第三部分　　　目的： 研究SDF-1α對EPCs衰老的影響。 方法： 采用密度梯度離心法從外周血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板，培養(yǎng)4d后，收集貼壁細(xì)胞。多波長激光共聚焦顯微鏡鑒定FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細(xì)胞為正在分化的EPCs，流式細(xì)胞儀檢測其表面標(biāo)志進(jìn)一步鑒定EPCs。RT-PCR檢測CXCR4及hTERT mRNA水平。采用SA-β-半乳

13、糖苷酶染色試劑盒檢測衰老細(xì)胞。端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)-ELISA定量檢測端粒酶活性，TRAP-聚丙烯酞胺凝膠電泳(PAGE)-銀染法定性檢測端粒酶活性。MTT和集落生成能力測定實(shí)驗(yàn)檢測EPCs的增殖能力和集落形成能力。Western blot檢測EPCs Akt Ser473磷酸化水平。 結(jié)果： SDF-1α能減少SA-β-半乳糖苷酶

14、陽性細(xì)胞數(shù)量，SA-β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)量隨著SDF-1α濃度的增加而減少。SDF-1α僅可以促進(jìn)EPCs hTERT mRNA的表達(dá)。SDF-1α增加EPCs端粒酶活性。CXCR4受體阻斷劑(AMD3100)，P13K抑制劑(LY294002)可以抑制SDF-1α對EPCs hTERT mRNA表達(dá)及端粒酶活性的促進(jìn)作用。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)SDF-1α可以促進(jìn)Akt磷酸化。此外，SDF-1α干預(yù)后可增加EPCs的增殖