細(xì)胞自噬對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能影響的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　目前研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，是受損內(nèi)皮修復(fù)的主要參與者。EPCs主要存儲(chǔ)于骨髓、脾臟等器官，在生理或病理因素刺激下，EPCs從骨髓、脾臟等動(dòng)員，遷移到外周血并歸巢至損傷血管附近，參與受損內(nèi)皮的修復(fù)。然而，傳統(tǒng)方

2、式以EPCs移植為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療，由于受循環(huán)中多種心血管危險(xiǎn)因素的影響，移植后的EPCs生物學(xué)功能受到損害，增殖能力降低，生存能力減弱，局限了細(xì)胞治療向臨床的轉(zhuǎn)化。因此，尋求提高應(yīng)激條件下EPCs的生存能力，促進(jìn)EPCs增殖，改善受損內(nèi)皮的修復(fù)，對(duì)有效防治動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病具有重要意義。
　　自噬(autophagy)是真核細(xì)胞特有的降解長(zhǎng)壽命蛋白和受損細(xì)胞器的主要途徑，也是細(xì)胞適應(yīng)不利環(huán)境，維持穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)生存的重要方式。細(xì)

3、胞自噬受多種因素的影響，目前研究認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡是影響自噬水平的重要因素;然而由于胞內(nèi)外鈣信號(hào)的復(fù)雜變化，鈣離子對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)控的信號(hào)通路及自噬水平的變化趨勢(shì)尚存爭(zhēng)議。EPCs作為非興奮細(xì)胞，鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）是其主要鈣內(nèi)流的方式，由鈣庫(kù)操縱性鈣通道(store operated calcium channels，SOCC)復(fù)合體介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，EPCs

4、上不僅普遍表達(dá)SOCC復(fù)合體組成蛋白STIM1、TRPC1和ORAI1，并且與EPCs的眾多生物學(xué)功能密切相關(guān)。因此，這提示我們SOCC復(fù)合體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流可能參與了EPCs自噬水平的調(diào)控，而通過(guò)對(duì)EPCs自噬水平的調(diào)節(jié)將有助于增強(qiáng)EPCs在應(yīng)激條件下的生存能力，提高移植后循環(huán)中EPCs的生存效率，進(jìn)一步改善受損內(nèi)皮的修復(fù)。
　　基于以上原因，本研究利用動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠及體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素-氧化型低密度脂蛋白(oxid

5、ized low density lipoprotein，ox-LDL)，探討SOCE介導(dǎo)的細(xì)胞自噬在EPCs生物學(xué)功能中的作用及機(jī)制，尋求提高細(xì)胞自噬的臨床藥物，為提高EPCs移植效率提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　方法：
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖、遷移能力及和自噬水平的變化
　　2.ox-LDL對(duì)大鼠EPCs增殖、遷移能力，SOCE及細(xì)胞自噬水平的影響
　　3.SOCE-CAMKK2-MTOR介導(dǎo)的

6、細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系
　　4.匹伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬影響EPCs功能
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖、遷移能力及自噬水平的變化
　　1.1 動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠建立及EPCs的培養(yǎng)、鑒定
　　成功構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，在小鼠主動(dòng)脈處可見(jiàn)明顯的脂質(zhì)斑塊的形成。成功分離、培養(yǎng)及鑒定EPCs，分離第1日細(xì)胞可見(jiàn)呈圓形的貼壁狀態(tài)，第三日可見(jiàn)細(xì)胞呈鋪路石樣改變，第五日可見(jiàn)細(xì)胞呈梭形

7、、紡錘形改變，并呈線(xiàn)樣排列。流式細(xì)胞儀分析后顯示大部分細(xì)胞為VEGFR2、CD133、CD34陽(yáng)性細(xì)胞。熒光染色后顯示大部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物(UEA)并具有結(jié)合LDL的能力。
　　1.2 動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖和遷移功能的變化
　　利用CCK-8分析動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs增殖活性，可見(jiàn)高脂飲食12周后EPCs增殖能力顯著降低，高脂飲食16周后EPCs增殖能力進(jìn)一步降低。Transwell結(jié)果提

8、示高脂飲食12周后EPCs遷移能力降低，高脂飲食16周后進(jìn)一步降低。
　　1.3 動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs的自噬水平的變化
　　分離培養(yǎng)動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs7天后，檢測(cè)胞內(nèi)自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)，可見(jiàn)隨著動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)比例降低，p62表達(dá)增加，激光共聚焦顯微鏡下自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量減少。
　　2.ox-LDL對(duì)EPCs增殖、遷移能力，SOCE及細(xì)胞自噬水平的影響
　　2.1 在觀

9、察到動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠EPCs生物學(xué)功能和自噬水平的改變后，我們采用動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素ox-LDL體外模擬動(dòng)脈粥樣硬化形成微環(huán)境。通過(guò)CCK-8分析我們發(fā)現(xiàn)ox-LDL呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性降低EPCs增殖能力。在遷移小室實(shí)驗(yàn)中，ox-LDL同樣顯著降低EPCs遷移能力。
　　2.2 在檢測(cè)到ox-LDL對(duì)EPCs增殖、遷移能力的影響之后，我們檢測(cè)EPCs內(nèi)鈣濃度，發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理后，EPCs內(nèi)鈣濃度顯著增加，ox-LDL是否

10、通過(guò)SOCE引起胞內(nèi)鈣濃度變化的，我們進(jìn)一步在激光共聚焦下觀察到ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs后引起了胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放，5分鐘后再向無(wú)鈣的細(xì)胞外液中加入2 mM鈣離子，進(jìn)一步引起了胞內(nèi)鈣濃度的增加，胞內(nèi)鈣的再次增加是通過(guò)SOCE介導(dǎo)，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。我們根據(jù)公式計(jì)算得到細(xì)胞內(nèi)實(shí)際鈣離子濃度，我們證實(shí)ox-LDL激活SOCE引起EPCs內(nèi)鈣水平增加。此外，STIM1作為SOCC重要組成蛋白，STIM1是否參與ox-LDL誘導(dǎo)的SOCE，我們

11、檢測(cè)ox-LDL處理后STIM1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)60和100μg/ml ox-LDL暴露12小時(shí)后顯著增強(qiáng)STIM1表達(dá)。
　　2.3 根據(jù)以上結(jié)果我們確定60μg/ml為后續(xù)實(shí)驗(yàn)組ox-LDL濃度，我們采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式沉默SOCC復(fù)合體關(guān)鍵蛋白STIM1，隨后再用60μg/ml ox-LDL瞬時(shí)刺激EPCs，在共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)在STIM1沉默組ox-LDL引起胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放的鈣振幅顯著減弱，同時(shí)在細(xì)胞外液中補(bǔ)充2 mM濃度的鈣

12、離子后，STIM1沉默組的SOCE振幅依然顯著低于對(duì)照組。我們?cè)谘a(bǔ)充外液鈣離子前30秒用SOCE特異性抑制劑50μM2-APB預(yù)處理細(xì)胞，結(jié)果顯示2-APB組能夠顯著抑制ox-LDL引起的SOCE，進(jìn)一步證實(shí)ox-LDL激活SOCE。
　　2.4 隨后我們檢測(cè)ox-LDL對(duì)EPCs自噬水平的影響，發(fā)現(xiàn)ox-LDL呈劑量-時(shí)間依賴(lài)性顯著增加EPCs內(nèi)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例，結(jié)果顯示ox-LDL增強(qiáng)EPCs自噬水平。結(jié)合自噬體和溶酶體

13、特異性阻斷劑BAFA1和CQ，我們?cè)诩す夤簿劢癸@微鏡下發(fā)現(xiàn)ox-LDL促進(jìn)EPCs自噬流。
　　3.SOCE-CAMKK2-MTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬與EPCs功能的關(guān)系
　　3.1 細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑(BAPTA-AM)和細(xì)胞外鈣離子螯合劑(EGTA)預(yù)處理后顯著逆轉(zhuǎn)ox-LDL引起的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加(p＜0.01)，同時(shí)共聚焦顯微鏡下也顯示細(xì)胞內(nèi)外鈣離子螯合劑預(yù)處理后，減少了ox-LDL引起的自噬體和自噬溶酶體的增加(

14、p＜0.01)。
　　3.2 隨后我們探究ox-LDL是如何激活EPCs自噬的，發(fā)現(xiàn)60μg/ml ox-LDL處理EPCs12小時(shí)后，增加了CAMKK2(p＜0.01)和AMPK(p＜0.01)磷酸化水平，降低了MTOR(p＜0.01)和P70S6K(p＜0.01)的磷酸化水平。采用CAMKK2特異性抑制劑預(yù)處理后，在顯著降低ox-LDL引起的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ(p＜0.01)比例的同時(shí)，逆轉(zhuǎn)了ox-LDL對(duì)AMPK(p＜0.0

15、1)磷酸化，增加了MTOR(p＜0.01)和P70S6K(p＜0.01)的磷酸化。此外，通過(guò)慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染沉默STIM1后，ox-LDL上調(diào)的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和CAMKK2磷酸化被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證實(shí)，ox-LDL通過(guò)SOCE-CAMKK2-MTOR通路激活EPCs自噬。
　　3.3 為進(jìn)一步探究自噬與EPCs功能的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)沉默EPCs自噬后，RTCA和CCK-8結(jié)果顯示ox-LDL進(jìn)一步抑制EPCs增殖能力(p＜0.01)

16、;此外，采用自噬抑制劑3-MA預(yù)處理后再暴露于ox-LDL，EPCs增殖能力也進(jìn)一步抑制(p＜0.01)。該結(jié)果證實(shí)ox-LDL激活的自噬保護(hù)應(yīng)激環(huán)境下EPCs增殖能力。
　　4.匹伐他汀通過(guò)調(diào)節(jié)自噬影響EPCs功能
　　我們?cè)趯で筇岣逧PCs功能的藥物中發(fā)現(xiàn)，匹伐他汀(Pitavastatin，PTV)顯著提高EPCs增殖和遷移能力的同時(shí)上調(diào)了自噬關(guān)鍵蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例，降低了p62的表達(dá)，激活了EPCs自噬。當(dāng)

17、我們采用慢病毒沉默自噬后，PTV改善EPCs增殖和遷移能力被逆轉(zhuǎn);此外，自噬抑制劑3-MA預(yù)處理EPCs后，PTV改善EPCs增殖和遷移的能力同樣被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果證明，PTV通過(guò)增強(qiáng)EPCs自噬的方式改善EPCs功能。
　　結(jié)論：
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠中EPCs增殖、遷移能力減弱，自噬水平降低;
　　2.體外ox-LDL模擬動(dòng)脈粥樣硬化形成微環(huán)境，EPCs增殖、能力減弱，SOCE被激活，自噬水平增強(qiáng);