Visfatin對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是Asahara在1997年首次描述的一種來(lái)源于骨髓存在于外周血并且能夠定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。EPCs具有增殖和修復(fù)能力，在機(jī)體血管組織損傷后，EPCs通過(guò)動(dòng)員、遷移、歸巢以及形成毛細(xì)血管網(wǎng)一系列過(guò)程，促進(jìn)血管損傷部位內(nèi)皮再生和修復(fù)。EPCs尚能分泌生長(zhǎng)因子激活血管局部的成熟內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步參與血管修復(fù)過(guò)程。目前隨著人們生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率

2、逐年上升，心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死因。研究表明糖尿病患者EPCs數(shù)量減少、功能損傷與心血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，EPCs數(shù)量減少和功能下降被認(rèn)為是心血管疾病的標(biāo)志。EPCs受多種因素的影響，肥胖、高血壓、高血糖、脂代謝紊亂等患者均存在EPCs數(shù)量減少及功能受損。
　　Visfatin由脂肪細(xì)胞分泌。研究發(fā)現(xiàn)，visfatin在2型糖尿病患者和代謝綜合征患者體內(nèi)，尤其是有動(dòng)脈粥樣硬化病變的患者體內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)。在代謝相關(guān)疾

3、病中visfatin水平變化導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮功能受損，其可能是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中影響炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　糖尿病患者存在EPCs功能受損，而visfatin是影響血管內(nèi)皮功能的重要因素，我們前期研究發(fā)現(xiàn)visfatin能夠損傷大鼠EPCs遷移、粘附功能，但具體機(jī)制不詳。本研究從EPCs凋亡這一角度探討visfatin損傷EPCs的具體機(jī)制。
　　目的:觀察visfatin對(duì)EPCs凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討visfat

4、in誘導(dǎo)凋亡的具體機(jī)制。
　　方法:采用密度梯度離心法分離健康分娩婦女臍帶血中的單個(gè)核細(xì)胞，接種到纖維連接蛋白(fiber protein，F(xiàn)N)包被的培養(yǎng)皿中，經(jīng)EMG-2MV（20％胎牛血清，1％青霉素鏈霉素雙抗，0.04％氫化可的松，0.1％肝素，0.1％維生素C，50ng/ml胰島素樣生長(zhǎng)因子1，10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子，50ng/ml成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，50ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，10μg/ml纖維連接蛋白）重懸，

5、在37℃、5％CO2、濕度95％恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)第7天，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs表面特異性抗原CD34與CD309表達(dá)，采用激光共聚焦顯微鏡鑒定EPCs特性。細(xì)胞經(jīng)同步化處理后，第8天隨機(jī)將EPCs分為visfatin不同濃度（0，50，100，150ng/ml）干預(yù)組與抑制劑組。Visfatin不同濃度干預(yù)組孵育EPCs48小時(shí)。抑制劑組分別加上visfatin抑制劑FK866(10μM)與核因子

6、-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)抑制劑BAY11-7085（5μM）孵育EPCs1小時(shí)后，分別加入150ng/ml visfatin孵育EPCs48小時(shí)。收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Real-Time PCR檢測(cè)EPCs中天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3，caspase3)、Bax、Bcl-2、NF-κB的mRNA表達(dá)水平

7、，Westem Blot檢測(cè)EPCs中caspase3、Bax、Bcl-2、NF-κB、白細(xì)胞介素-6（inter-leukin-6，IL-6）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule1，ICAM1）蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1、EPCs的分離培養(yǎng)與鑒定
　　分離單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)48小時(shí)后大部分細(xì)胞貼壁，呈鵝卵石樣。以后細(xì)胞逐漸伸展，形態(tài)改變，呈紡錘狀。10天以后部分細(xì)胞

8、聚集成集落樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD34與CD309雙陽(yáng)細(xì)胞為EPCs。激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)EPCs可以攝取1，1'-二（十八烷基）-3，3'，3'，3'-四甲基吲哚羰基花青高氯酸（DiI）乙?；兔芏戎鞍?Acetylated Low DensityLipoprotein，Ac-LDL)(DiI-Ac-LDL)，呈紅色，結(jié)合FITC標(biāo)記荊豆凝集素-1（Ulex europaeus agglutinin-1，UEA-1）(FITC-

9、Lectin-UEA-1)，呈綠色，雙染細(xì)胞呈橘黃色。
　　2、Visfatin對(duì)EPCs凋亡的影響:
　　與0 ng/ml組相比，visfatin（50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml）呈劑量依賴誘導(dǎo)EPCs凋亡，150ng/ml visfatin組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05); caspase3、Bax mRNA與蛋白表達(dá)升高，150ng/ml visfatin組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，Bcl-2 m

10、RNA與蛋白表達(dá)下降，各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);150ng/ml visfatin組Bax/Bcl-2 mRNA與蛋白比值均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與150ng/ml visfatin組相比，抑制劑FK866干預(yù)組凋亡率下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);caspase3、Bax mRNA與蛋白表達(dá)、Bax/Bcl-2 mRNA與蛋白比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，Bcl-2 mRNA與蛋白表達(dá)

11、升高，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3、Visfatin對(duì)EPCs中炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響
　　與0ng/ml組相比，visfatin(50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml)組EPCs的IL-6與ICAM1蛋白表達(dá)升高，150ng/ml visfatin組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與150ng/ml visfatin組相比，抑制劑FK866干預(yù)組ICAM1蛋白表達(dá)下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)

12、，IL-6蛋白表達(dá)降低，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　4、NF-κB在visfatin誘導(dǎo)EPCs凋亡中的作用
　　與0ng/ml組相比，visfatin(50ng/ml，100ng/ml，150ng/ml)組EPCs中NF-κB的mRNA與蛋白表達(dá)升高，150ng/ml visfatin組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與150ng/ml visfatin組相比，BAY11-7085干預(yù)組EPCs凋亡受到抑制，caspase3、Bax

13、的mRNA與蛋白表達(dá)下降，Bcl-2的mRMA與蛋白表達(dá)升高，ICAM1與IL-6蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、用密度梯度離心法分離的人臍靜脈單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)EMG-2MV培養(yǎng)后，可以分化為CD309、CD34表達(dá)陽(yáng)性的EPCs。
　　2、Visfatin呈劑量依賴誘導(dǎo)EPCs凋亡，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的mRNA與蛋白表達(dá)。
　　3、Visfatin通過(guò)激活NF-κB通路，誘導(dǎo)EP