槲皮素對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究氧自由基對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的損傷及槲皮素(quercetin,Que)的保護(hù)作用,并探討可能機(jī)制。
　　 方法:(1)外周單個(gè)核細(xì)胞的分離:抽取健康足月孕產(chǎn)婦胎盤(pán)臍帶血60ml,按20U/ml加入普通肝素抗凝,采用明膠沉淀法聯(lián)合密度梯度離心法分離獲得單個(gè)核細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞活力計(jì)算(死細(xì)胞藍(lán)色、活細(xì)胞不著色),活細(xì)胞占98％以上可進(jìn)行接種,上述過(guò)程在四個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。(2)誘導(dǎo)分化:將細(xì)胞以4×106/cm2密度接種

2、于纖維連接蛋白包被的25cm2培養(yǎng)瓶中(4μg/cm2),加入5ml M199培養(yǎng)基,添加10％胎牛血清、1％青鏈霉素(1萬(wàn)單位/m1)、VEGF50ng/ml、b-FGF1ng/ml,置于5％CO2、飽和濕度、37℃孵育箱中,成纖維細(xì)胞多于24小時(shí)以?xún)?nèi)貼壁,24小時(shí)后取未貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至第四天,用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細(xì)胞,加培養(yǎng)液培養(yǎng)至第七天,進(jìn)一步用磷酸鹽緩沖液洗掉未貼壁細(xì)胞,貼壁細(xì)胞供試驗(yàn)用。(3)EPCs鑒定:利用免疫熒光法

3、檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志 CD133；用EPCs特異性抗體FITC-UEA-I和DiI-acLDL對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色。(4)分組及干預(yù):EPCs細(xì)胞培養(yǎng)七天后,0.25％胰酶消化收集貼壁細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),隨機(jī)分為空白對(duì)照組(不加干預(yù))；Que組(分別加入60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L濃度的 Que)；H2O2組(加入500μmol/L過(guò)氧化氫(H2O2))；Que+H2O2組(先加入Que60μmol/L、

4、90μmol/L、120μmol/L,后加500μmol/L H2O2共同培養(yǎng))。在96或6孔板中培養(yǎng)24小時(shí)后,用于各指標(biāo)檢測(cè)。(5)EPCs增殖觀(guān)察:每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,采用 WST-1法檢測(cè) Que在有或無(wú)H2O2作用下對(duì)EPCs24小時(shí)和48小時(shí)增殖的影響。(6)EPCs凋亡的觀(guān)察:采用異硫氰酸熒光標(biāo)記的 Annexin—v、PI雙染色免疫熒光法檢測(cè)EPCs的凋亡,并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè) Que

5、對(duì)H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響。(7)凋亡機(jī)制的研究:免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)空白對(duì)照組、H2O2組、Que+H2O2組的 p-JNK蛋白表達(dá),加入 JNK激動(dòng)劑 Anisomycin10μmol/L后用流式細(xì)胞儀觀(guān)察各組凋亡率的變化。
　　 結(jié)果:(1)與空白對(duì)照組比較,60～90pmol/L的Que可以促進(jìn)EPCs的增殖,120μmol/L的 Que則表現(xiàn)出抑制EPCs增殖的作用,與培養(yǎng)24小時(shí)比,在48小時(shí)對(duì)EPCs的抑制作

6、用較為明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)與空白對(duì)照組比較,H2O2組 EPCs增殖能力明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。加入60～120μmol/L的Que處理后,H2O2誘導(dǎo)的EPCs損傷后的細(xì)胞增殖能力得到明顯改善,且具有明顯的時(shí)間和濃度依賴(lài)性,與H2O2組比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(3)Que在60μmol/L~120μmol/L范圍內(nèi)隨著濃度的增加,使 H2O2誘導(dǎo)的EPCs凋亡率逐漸

7、降低。在60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L濃度的 Que作用下,凋亡率依次為(27.43±0.58)％、(23.12±0.37)％、(22.43±0.16)％,與H2O2組((36.58±0.45)％)比較,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與90μmol/L Que+H2O2組比較,120μmol/L Que+H2O2組的凋亡率無(wú)明顯差異(P>0.05)。(4)p-JNK陽(yáng)性表達(dá)顯示細(xì)胞胞漿和胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒

8、,隨著槲皮素濃度的增加,p-JNK陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物逐漸減少,染色變得淺淡。Que能夠抑制加入JNK激動(dòng)劑后EPCs凋亡率的增加,Anisomycin+Que(60μmol/L、90μmol/L、120μmol/L)+H2O2組的凋亡率依次為(42.36±0.53)％、(38.32±0.30)％、(35.78±0.54)％,與Anisomycin+H2O2組((47.35±0.64)％)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。