脂聯(lián)素對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、人們生活水平的提高以及一些不良生活和/或飲食方式的長期存在，導(dǎo)致肥胖癥、糖耐量減低、胰島素抵抗和2型糖尿病患病人群數(shù)量不斷上升，這已經(jīng)成為一個公共衛(wèi)生問題，引起內(nèi)分泌、心腦血管疾病等臨床醫(yī)生以及公共衛(wèi)生研究學(xué)者的高度重視。臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查已經(jīng)證實(shí)，這些代謝性疾病與心血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切，代謝綜合癥和2型糖尿病已經(jīng)被認(rèn)為是冠心病的等危癥。肥胖所導(dǎo)致的炎癥因子分泌的增加是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要因素，也是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損害和功能紊亂的原因

2、之一。2型糖尿病患者過高的血糖狀態(tài)同樣對血管內(nèi)皮尤其是微循環(huán)血管內(nèi)皮會造成損害，這對增加動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的發(fā)生和促進(jìn)病變的進(jìn)一步發(fā)展非常重要。 脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的特異性的脂肪細(xì)胞因子，與肥胖、糖耐量異常、胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)，患有這些疾病的人群血漿脂聯(lián)素水平顯著下降。最近研究表明，脂聯(lián)素通過抑制泡沫細(xì)胞的形成、抑制細(xì)胞凋亡、減少炎癥因子的產(chǎn)生和聚集從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化病變的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能

3、狀態(tài)與各種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。在內(nèi)皮損傷或高血糖等因素刺激下，血管內(nèi)皮功能會發(fā)生紊亂。與正常人群相比，患有高血壓、冠心病等心血管疾病的人群血漿脂聯(lián)素水平顯著降低。目前，低脂聯(lián)素血癥被認(rèn)為是冠心病獨(dú)立的危險因素和預(yù)測因子，同時與冠心病病變嚴(yán)重程度密切相關(guān)，因此也被作為預(yù)后預(yù)測的指標(biāo)之一。 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一類能增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不僅參與胚胎時

4、期血管的形成，也參與出生后血管的新生和內(nèi)皮損傷的修復(fù)，這對于預(yù)防和治療各類與血管損傷有關(guān)的心血管疾病有著重要的病理和生理學(xué)意義。有關(guān)EPCs在各種缺血性疾病和創(chuàng)傷治療中的應(yīng)用以及如何有效促進(jìn)機(jī)體EPCs的增殖分化是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠造血干細(xì)胞(hematopoieticstemcells，HSCs)表面存在脂聯(lián)素受體，脂聯(lián)素可促進(jìn)HSCs在體內(nèi)外的增殖并提高其功能，被認(rèn)為是其不可缺少的生長因子。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)

5、胞的前體細(xì)胞，同時具有內(nèi)皮細(xì)胞和祖細(xì)胞的一些生物學(xué)特性。EPCs是否也表達(dá)脂聯(lián)素受體，脂聯(lián)素對EPCs的增殖和分化功能有無影響目前尚不清楚。 基于上述的理論基礎(chǔ)，我們提出假設(shè)：脂聯(lián)素可能影響EPCs的數(shù)量和功能，從而影響血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)能力，維持內(nèi)皮損傷和修復(fù)之間的動態(tài)平衡，促進(jìn)內(nèi)皮功能的恢復(fù)，進(jìn)而延緩動脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展．因此，本實(shí)驗(yàn)的目的是了解EPCs中是否存在脂聯(lián)素受體的表達(dá)，以及脂聯(lián)素是否影響EPCs的增殖和分

6、化，同時探討其可能的作用機(jī)制。以下分2部分對本研究的方法、結(jié)果和結(jié)論等作一簡述。 第一部分內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及脂聯(lián)素受體的表達(dá) 目的：對臍血EPCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)和鑒定；探討EPCs是否存在脂聯(lián)素受體的表達(dá)。 方法：采用Ficoll密度梯度離心法從人臍靜脈血中獲得單個核細(xì)胞，接種于預(yù)包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，經(jīng)貼壁篩選法純化，用FITC—IYEA—I和DiI—Ac—LDL雙染色法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測

7、EPCs表面標(biāo)志(CD34、VEGFR-2和AC133)來驗(yàn)證分離、培養(yǎng)所得EPCs；并通過RT—PCR、Westernblot和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法檢驗(yàn)EPCs中是否存在脂聯(lián)素受體的表達(dá)。 結(jié)果：培養(yǎng)所得的細(xì)胞81.4±11.7％為FITC—UEA—I和DiI—Ac—LDL染色呈雙陽性；用流式細(xì)胞技術(shù)檢測其表達(dá)VEGFR-2(76.6±7.0％)、CD34(42.9±8.5％)、AC133(19.8±3.9％)；脂聯(lián)素受體Adi

8、poR1和AdipoR2的mRNA和蛋白EPCs上均有表達(dá)。 結(jié)論：1．采用密度梯度離心后貼壁篩選培養(yǎng)的方法可以從人臍靜脈血中成功分離培養(yǎng)EPCs。2．分離培養(yǎng)的EPCs中存在脂聯(lián)素受體AdipoR1和AdipoR2的表達(dá)。 第二部分脂聯(lián)素對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化的影響及其機(jī)制探討 目的：觀察脂聯(lián)素對分離培養(yǎng)的EPCs增殖分化的影響并初步探討其可能的作用機(jī)制。 方法：分離的EPCs培養(yǎng)15-20天后，用MTT

9、法觀察脂聯(lián)素對EPCs增殖的影響。用RealtimePCR檢測vWF、CD31、CD34、AC133相對表達(dá)量評價脂聯(lián)素對EPCs分化的影響。用Westernblot檢測脂聯(lián)素作用后不同時間p—JNK、JNK、p—p38、p38、ERK、p—ERK等蛋白的表達(dá)，并用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑SB203580和SP600125干預(yù)加以驗(yàn)證脂聯(lián)素對EPCs增殖分化影響的可能信號傳導(dǎo)途徑。 結(jié)果：脂聯(lián)素作用后能使EPCs數(shù)量(及其MTT值)增加，

10、30μg/ml和作用48h時最明顯；脂聯(lián)素(30μg/ml)干預(yù)48h后細(xì)胞表達(dá)vWF、CD31mRNA的相對量有所增加，而CD34、AC133mRNA的表達(dá)水平則有下降；脂聯(lián)素干預(yù)后5min，可檢測到EPCs中p38和JNK磷酸化，30min達(dá)高峰，60min稍有下降，而ERK無磷酸化(p—ERK)表達(dá)。p38信號傳導(dǎo)抑制劑SB203580和JNK信號傳導(dǎo)抑制劑SP600125則可阻斷脂聯(lián)素的促進(jìn)p38和JNK磷酸化作用；SB2035