脂聯(lián)素對高糖刺激下內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用及其對氧化水平的影響.pdf

1、目的:
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)又稱為成血管細(xì)胞，不僅參與胚胎時期的血管生成，而且參與出生后的血管新生與內(nèi)皮損傷修復(fù)。糖尿病合并心血管并發(fā)癥患者的EPCs數(shù)量減少，功能減退，能夠?qū)е卵茉賰?nèi)皮化及修復(fù)過程受損。脂聯(lián)素(adiponectin，APN)是一種脂肪源性血漿蛋白，對心血管具有保護(hù)作用。APN具有抗炎和抗動脈粥樣硬化的作用，可促進(jìn)血管生成；另外，APN還可以通

2、過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，來減少心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌肥厚性重構(gòu)。大量研究證明，經(jīng)過APN干預(yù)，可使EPCs的數(shù)量增加。然而，APN是否能改善高糖環(huán)境下EPCs的數(shù)量和功能尚未清楚。為此，我們通過實(shí)驗(yàn)給予EPCs不同濃度的葡萄糖干預(yù)，觀察葡萄糖對EPCs數(shù)量和功能的影響；在此基礎(chǔ)上，給予不同濃度的APN干預(yù)，觀察各濃度APN對高糖損傷后EPCs數(shù)量和功能的影響以明確APN對EPCs的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制，為臨床治療代謝綜合征性心血管

3、疾病提供新的干預(yù)靶點(diǎn)和必要的科學(xué)理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞，經(jīng)含堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及10％胎牛血清的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，進(jìn)行形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀測細(xì)胞分子標(biāo)志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞攝取ac-LDL和結(jié)合UEA-I鑒定。
　　 2、不同濃度葡萄

4、糖對EPCs的影響：收集培養(yǎng)4d的細(xì)胞，給予不同濃度的葡萄糖(5.5、20、25、30、50mmol/l)干預(yù)48h，同步化后用MTT比色法檢測EPCs的增殖能力；用AnnexinV-FITC法檢測EPCs的凋亡率；用熒光探針(DCFH-DA)檢測法進(jìn)行細(xì)胞活性氧(ROS)水平檢測。
　　 3、APN對高糖環(huán)境下EPCs的影響：將培養(yǎng)4d的EPCs分為7組：其中3組細(xì)胞分別給予5.5mmol/l葡萄糖、5.5mmol/l葡萄糖+

5、24.5mmol/l甘露醇、30mmol/l葡萄糖干預(yù)96h，其余4組細(xì)胞先給予30mmol/l葡萄糖干預(yù)48h，然后分別給予：1.25μg/ml、2.5μg/ml、51μg/ml和10μg/mlAPN干預(yù)48h。收集細(xì)胞，同步化后檢測EPCs的增殖、遷移、凋亡及ROS水平。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)處理方法：用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X-±s表示，組間資料比較采用ANOVA，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。<

6、br>　　 結(jié)果:
　　 1、EPCs培養(yǎng)和鑒定：密度梯度離心法分離出的外周血單個核細(xì)胞圓形透亮，培養(yǎng)4d后出現(xiàn)短梭形貼壁細(xì)胞，并有典型細(xì)胞集落；培養(yǎng)7d，細(xì)胞集落增加明顯，梭形細(xì)胞增多并呈交叉性生長；用激光共聚焦倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞攝取DiI-acLDL呈紅色熒光，攝取FITC-UEA-I呈綠色熒光，攝取DiI-acLDL并結(jié)合FITC-UEA-I的細(xì)胞呈黃色熒光，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果提示：細(xì)胞表達(dá)KDR、CD133、CD34

7、，其中KDR、CD133、CD34陽性細(xì)胞比例為92.32％、10.7％、23.3％。證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是正在分化的EPCs。
　　 2、不同糖濃度對EPCs的影響：當(dāng)糖濃度分別為5.5mmol/1、20mmol/1、25mmol/1、30mmol/1、50mmol/1時MTT法測出的A值分別為(0.287±0.031)、(0.252±0.034)、(0.242±0.019)、(0.215±0.024)、(0.208±0.017)，

8、凋亡率分別為(8.495±1.279)％、(12.942±1.177)％、(14.770±1.438)％、(16.393±1.216)％、(17.502±1.259)％，DCF法測出的ROS水平(OD值)分別為(0.361±0.053)、(0.468±0.090)、(0.483±0.053)、(0.518±0.081)、(0.613±0.098)。結(jié)果提示，隨著糖濃度的增高，EPCs的增殖能力下降，凋亡、ROS水平增加(P<0.01)；

9、其中當(dāng)糖濃度為30mmol/1與50mmol/1時，兩者相比對EPCs的影響無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、APN對高糖損傷后EPCs的影響：對以下7組細(xì)胞(5.5mmol/1葡萄糖組、高滲組、30mmol/1高糖組、高糖+1.25μg/mlAPN組、高糖+2.5μg/mlAPN組、高糖+5μg/mlAPN組、高糖+10μg/mlAPN組)進(jìn)行檢測的結(jié)果分析后可以看出與正常糖濃度對照組相比，高滲對照組EPCs的增殖、遷

10、移、凋亡和ROS水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，卻顯著高于高糖組，說明高糖對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響是糖濃度造成的，而非滲透壓。在30mmol/1葡萄糖條件下，EPCs的數(shù)量和遷移功能較正常對照組明顯下降，細(xì)胞凋亡增多，不同濃度APN干預(yù)后能明顯提高高糖損傷后的EPCs的功能(P<0.05)，隨著APN濃度的增加，EPCs的增殖與遷移能力增高，凋亡、ROS水平下降(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖干預(yù)可導(dǎo)致EPC