高糖環(huán)境對兔骨髓內(nèi)皮祖細胞和循環(huán)晚期內(nèi)皮祖細胞功能影響的對比研究.pdf

1、高糖環(huán)境對兔骨髓內(nèi)皮祖細胞和循環(huán)晚期內(nèi)皮祖細胞功能影響的對比研究背景：糖尿病血管病變嚴重，發(fā)病年齡輕，進展快，累及范圍廣，并且伴有嚴重的側(cè)支動脈發(fā)育受損，是造成糖尿病死亡的主要原因。內(nèi)皮祖細胞(EPC)是骨髓干細胞的一種亞群，是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，不僅在血管新生中作用顯著，也有強烈的內(nèi)皮保護作用。成年人體內(nèi)存在骨髓內(nèi)皮祖細胞(BM-EPC)和循環(huán)內(nèi)皮祖細胞(circulating EPC)，后者又具有兩種亞型，循環(huán)早期內(nèi)皮祖細胞(e

2、arlvEPC)和循環(huán)晚期內(nèi)皮祖細胞(late EPC)。研究發(fā)現(xiàn)，無論是1型還是2型糖尿病，其內(nèi)皮祖細胞的增殖、黏附、整合入血管結(jié)構(gòu)以及成血管能力均顯著下降，糖尿病血管病變與其內(nèi)皮祖細胞功能不全密切相關(guān)。然而糖尿病影響內(nèi)皮祖細胞功能的機制、糖尿病對不同來源內(nèi)皮祖細胞功能影響是否存在差別、內(nèi)皮祖細胞移植是否會改善高糖環(huán)境下缺血心肌的灌注等遠未明確。 目的： 1．探討B(tài)M-EPC和late EPC的生物學特征差異。

3、 2．探討高糖、高胰島素對體外培養(yǎng)的BM-EPC和late EPC增殖以及血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)mRNA表達的影響。 3．探討四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病對兔BM-EPC和late EPC集落形成能力以及增殖和黏附功能的影響。 4．探討糖尿病來源的BM-EPC和late EPC心肌內(nèi)移植對四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病兔急性心肌梗死的修復(fù)作用。 方法： 1．分別抽取健康兔骨髓4

4、ml和外周血10ml，采用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，在含有VEGF、bFGF、IGF、EGF 的 DMEM/DF12 或 M199 培養(yǎng)液中培養(yǎng) BM-EPC 和 late EPC；流式細胞儀檢測兩種細胞的細胞表面標志 CD14、CD34、CD45、CD54、CD105、CD106、CD133、KDR和vWF的陽性率；激光共聚焦顯微鏡檢測兩種細胞吞噬ac-LDL以及結(jié)合UEA-1的能力。 2．收集健康兔來源的P2代BM-EP

5、C和 late EPC，分為5組：對照組(5.5mmol/l葡萄糖)，glucosell組(1lmmol/l葡萄糖)，glucose30組(30mmol/l葡萄糖)，ins100組(100nmol/l胰島素)，ins1000組(1000nmol/l胰島素)，采用不同濃度的葡萄糖和胰島素刺激。MTT法檢測刺激48小時和96小時后兩種細胞的增殖能力。RT-PCR法檢測兩種細胞在接受高糖、高胰島素刺激96小時后VEGF和bFGF mRNA表達

6、的水平。 3．四氧嘧啶誘導(dǎo)兔糖尿病模型后4周，培養(yǎng)糖尿病組(n=6)和對照組(n=6)動物BM-EPC和late EPC。分別檢測原代培養(yǎng)的兩組BM-EPC和late EPC集落形成數(shù)，以MTT法檢測細胞增殖，并檢測細胞對纖維連接蛋白的黏附能力。 4．四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病模型后將動物分為對照組(n=8)，骨髓內(nèi)皮祖細胞移植組(n=8)和循環(huán)晚期內(nèi)皮祖細胞移植組(n=8)。糖尿病造模6周后結(jié)扎動物前降支造成急性心肌梗死模型，

7、之后于對照組心肌內(nèi)注射M199培養(yǎng)液200μl，骨髓內(nèi)皮祖細胞移植組注射BM-EPC 5×10<'6>，循環(huán)晚期內(nèi)皮祖細胞移植組注射lateEPC 5×10<'6>。以激光共聚焦顯微鏡觀察移植細胞的分布；以Masson三色染色法檢測細胞移植后心肌纖維化面積；以Ⅷ因子免疫組化法標記毛細血管，計算毛細血管密度；以心臟超聲觀察心功能的改變；以實時定量PCR檢測VEGF和bFGF的表達。 結(jié)果： 1．BM-EPC 與 late

8、EPC CD14，CD54，CD105，KDR，vWF 陽性率無差異(P>0.05)；BM-EPC CD45，CD133 陽性率高于late EPC(P<0.05)；BM-EPC 的 CD34和 CD106 陽性率低于 late EPC(P<0.05)；兩種細胞都能吞噬 ac-LDL 并結(jié)合UEA-1，吞噬 ac-LDL 的能力相當(P>0.05)。 2．高糖刺激48小時對BM-EPC增殖功能無明顯影響(P>0.05)，刺激96

9、小時后11mmol/l的葡萄糖促進BM-EPC的增殖(P<0.05)，而30mmol/1 葡萄糖與對照組無明顯差別(P>0.05)。高糖刺激48小時后，隨著葡萄糖濃度的增加，late EPC 增殖能力逐漸減弱(1P<0.05)；刺激96小時后葡萄糖仍呈濃度依賴性抑制 late EPC增殖，glucosell 組增殖能力較對照組明顯下降(P<0.05)，glucose30 組不但較對照組(P<0.01)也較glucosell組(P<0.0

10、5)明顯下降。胰島素刺激48小時可以促進BM-EPC的增殖，ins100組和ins1000組細胞增殖均較對照組增高(P<0.05)；而隨著培養(yǎng)時間的延長胰島素的促增殖作用則逐漸減弱(P>0.05)。高胰島素刺激48小時抑制 late EPC 細胞增殖，ins1000 組細胞增殖較對照組(P<0.01)和ins100 組(P<0.05)明顯降低；高胰島素刺激96小時后各組細胞增殖無明顯差別(P>0.05)。高糖對 BM-EPC 的 VEG

11、F mRNA 表達無明顯影響(P>0.05)，卻劑量依賴性地抑制late EPC的VEGF表達，glucosell 組和glucose30組VEGF的表達均較對照組降低(P<0.01)。與對照組比較，1lmmol/l葡萄糖刺激促進 BM-EPC 表達 bFGF(P<0.01)，但30mmol/l葡萄糖刺激則抑制bFGF的表達(P<0.01)。葡萄糖呈劑量依賴性地抑制late EPC表達 bFGF(ins100 組vs 對照組 P<0．0

12、5，ins1000組vs對照組P<0．01)。胰島素對BM-EPC表達VEGF無影響(P>0．05)，1000nmol/1 胰島素抑制BM-EPC 表達bFGF(P<0．05)。胰島素抑制late EPC表達VEGF和bFGF，ins100組和ins1000組VEGF和bFGF表達均較對照組降低(P<0．05)，兩組之間無差別。 3．四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病組和對照組兔BM-EPC的集落形成能力以及細胞增殖、黏附能力無差別(P>0．

13、05)。與對照組比較，糖尿病組late EPC集落形成數(shù)量減少(P<0．05)，細胞增殖能力下降(P<0．01)，黏附能力也明顯下降(P<0．01)。 4．BM-EPC和late EPC心肌內(nèi)移植后都可以整合到血管中，形成新生血管。與對照組比較，BM-EPC移植和late EPC移植都明顯增加毛細血管密度(P<0．01)，BM-EPC 組血管密度高于late EPC組(P<0．01)。與對照組比較，BM-EPC 移植減少心肌纖維

14、化面積(P<0．05)，而late EPC移植則無此作用(P>0．05)。BM-EPC 移植提高射血分數(shù)(P<0．05)，而 late EPC 移植則無此作用。BM-EPC 移植促進VEGF和bFGF的表達(P<0．05)，late EPC 移植組與對照組無差別(P>0．05)。 結(jié)論： 1．高糖環(huán)境對BM-EPC和late EPC功能的影響在體內(nèi)和體外均存在差異。四氧嘧啶誘導(dǎo)的體內(nèi)高糖環(huán)境對BM-EPC的數(shù)量和增殖、黏

15、附無抑制作用，但抑制late EPC的數(shù)量、增殖和黏附。體外高糖環(huán)境呈濃度依賴性抑制late EPC的增殖，但不抑制BM-EPC的增殖。 2．高糖抑制late EPC表達VEGF和bFGF，高糖對BM-EPC 表達 VEGF 無影響，30mmol/l高糖也抑制BM-EPC表達bFGF。 3．高胰島素抑制late EPC表達VEGF以及bFGF，抑制BM-EPC表達bFGF。 4．BM-EPC心肌內(nèi)移植通過促進血管