辛伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響.pdf

1、背景：膿毒癥是是目前患病率和死亡率最高的疾病之一，歐美國(guó)家膿毒癥的患病率在10％以上，我國(guó)缺乏相應(yīng)資料，但根據(jù)抗生素使用情況判斷，其患病率遠(yuǎn)在歐美國(guó)家之上，膿毒癥成為嚴(yán)重威脅著人類健康的最主要疾病之一；為降低膿毒癥的患病率和病死率，早在2002年就由多個(gè)國(guó)家學(xué)會(huì)共同提出了“surviving sepsiscampaign”，并根據(jù)大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)和廣泛論證，提出了“sepsis resuscitationbundles”和“Sepsis

2、 management bundle”，從2008年起在世界各地進(jìn)行推廣；經(jīng)過大量的努力，同時(shí)伴隨診療技術(shù)的不斷提高，2010年數(shù)據(jù)分析顯示膿毒癥的病死率仍在30.8％。如何降低其發(fā)病率和病死率是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究證明，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常及結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞脫落變形、凝血功能異常、毛細(xì)血管滲漏等在膿毒癥的病情進(jìn)展中其重要作用，成年內(nèi)皮細(xì)胞的自我增殖和修復(fù)能力有限，內(nèi)皮祖細(xì)胞是出生后血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的重要細(xì)胞，研究表明循

3、環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能直接影響到膿毒癥患者的預(yù)后。細(xì)菌脂多糖是革蘭氏陰性桿菌的主要致病原，實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用LPS體內(nèi)注射模擬機(jī)體感染過程；3-羥-3-甲基戊二酸輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑(他汀類藥物)通過抑制HMG-CoA還原酶的活性，而抑制膽固醇的生成、降低血膽固醇的水平，最近研究表明，在有效地調(diào)節(jié)血脂水平外，還具有抑制平滑肌增生和血小板聚集以及抑制炎癥

4、反應(yīng)等作用，有研究證明他汀類藥物還能促進(jìn)血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程，而且已經(jīng)證實(shí)EPCs在該過程中扮演了重要角色，研究證實(shí)他汀類藥物有動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞、提高內(nèi)皮功能等作用。自2000年Ando首先報(bào)道他汀類藥物可以改善大鼠膿毒癥的生存率后，多個(gè)大規(guī)模臨床觀察顯示，他汀類藥物能降低膿毒癥的患病率和病死率，但對(duì)于LPS對(duì)EPCs數(shù)量及功能的影響及他汀類藥物對(duì)LPS作用下的內(nèi)皮祖細(xì)胞作用未見相關(guān)報(bào)道。
　　 目的：⑴從臍靜脈血獲得人

5、EPCs，鑒定并進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)。⑵將脂多糖(LPS)與人臍血EPCs共孵育，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)添加不同劑量辛伐他汀，觀察LPS對(duì)人臍血EPCs增殖、遷移、黏附、凋亡的影響及辛伐他汀干預(yù)作用；⑶將不同濃度辛伐他汀與人臍血EPCs共孵育，相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)加入LPS，觀察辛伐他汀對(duì)EPCs增殖、遷移、黏附功能的影響，以及預(yù)先應(yīng)用辛伐他汀后LPS對(duì)人臍血EPCs增殖、遷移、黏附的影響；通過該研究明確在細(xì)胞水平單純LPS及辛伐他汀對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞祖的影響，及兩者

6、的相互影響，為進(jìn)一步進(jìn)行作用機(jī)理探討提供基礎(chǔ)。
　　 方法：第一部分：采用密度梯度離心法從臍靜脈血獲取單個(gè)核細(xì)胞，將其接種在人纖維連接蛋白包被培養(yǎng)板上，誘導(dǎo)培養(yǎng)7天，收集貼壁細(xì)胞，通過細(xì)胞形態(tài)觀察及DiI-acLDL、FITC-UEA-I染色激光共聚焦顯微鏡培養(yǎng)細(xì)胞。第二部分：將等量臍靜脈血來源EPCs(UCBEPCs)接種到96孔培養(yǎng)板上，隨機(jī)分為對(duì)照組：UCBEPCs與EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)48小時(shí)；LPS組，UCBEPC

7、s與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)48小時(shí)；LPS+simy0.1組：UCBEPCs與GN-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)24小時(shí)后，加入0.1μmol/L辛伐他汀培養(yǎng)至48小時(shí)；LPS+simv1.0組：UCBEPCs與GM-2MY標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)24小時(shí)后，加入1.0μmol/L辛伐他汀培養(yǎng)至48小時(shí)；LPS+simv10.0組：UCBEPCs與GM-2

8、MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)24小時(shí)后，加入10.0μ mol/L辛伐他汀培養(yǎng)至48小時(shí)。應(yīng)用MTT比色法測(cè)定EPCs增殖功能和粘附功能，通過Transwell小室觀察EPCs遷移功能。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，資料采用SPSS(16.0版)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較用隨機(jī)取組設(shè)計(jì)的方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。第三部分：將等量EPCs接種到96孔培養(yǎng)板上，隨機(jī)分為對(duì)照組：

9、UCBEPCs與EGM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液培養(yǎng)48小時(shí)；LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)48小時(shí)；Sim0.1+LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和0.1μmol/L辛伐他汀共同孵育24小時(shí)后，加入LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)至48小時(shí)；Sim1.0+LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和1.0μ mol/L辛伐他汀共同孵育24小時(shí)后，加入LPS液(100 ng/

10、mL)共同培養(yǎng)至48小時(shí)；Sim10.0+LPS組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和10.0μmol/L辛伐他汀共同孵育24小時(shí)后，加入LPS液(100 ng/mL)共同培養(yǎng)至48小時(shí)；辛伐他汀組：UCBEPCs與GM-2MV標(biāo)準(zhǔn)液和1.0μmol/L辛伐他汀共同孵育48小時(shí)。應(yīng)用MTT比色法測(cè)定EPCs增殖功能和粘附功能，通過Transwell小室觀察EPCs遷移功能，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs凋亡情況，細(xì)胞凋亡率(AP)計(jì)算公式

11、：AP=凋亡細(xì)胞數(shù)/總檢測(cè)細(xì)胞數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果中數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，資料采用SPSS(16.0版)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組問比較用隨機(jī)取組設(shè)計(jì)的方差分析，以P<0.05為差異有顯著性
　　 結(jié)果：第一部分：經(jīng)鑒定分離培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs，經(jīng)復(fù)蘇傳代見細(xì)胞生長(zhǎng)良好。第二部分：臍靜脈血來源EPCs與LPS共孵育后其增殖、遷移顯著降低(P=0.009、P=0.026)，黏附能力也下降，但差異無顯著性(P=0.279)

12、。臍靜脈EPCs與LPS共孵育后加入不同濃度辛伐他汀，EPCs的增殖、遷移和黏附能力不同程度改善，隨辛伐他汀濃度增加，該作用增強(qiáng)，辛伐他汀濃度為1.0μmol/L時(shí)EPCs增殖顯著改善(P=0.017)，濃度10.0μmol/L時(shí)EPCs增殖、黏附、遷移功能，較LPS組均顯著改善(P=0.00，P=0.002，P=0.00)，其中黏附和遷移功能較空白對(duì)照組顯著改善(P=0.039，P=0.000)。第三部分：人EPCs與LPS共孵育后其

13、凋亡率顯著增加(12.632±0.5271 vs3.0266±0.5271，P<0.00)。辛伐他汀(1.0umol/L)與EPCs共孵育，EPCs各檢測(cè)指標(biāo)與對(duì)照組比較均無顯著變化。UCBEPCs與不同濃度辛伐他汀孵育后再加入LPSEPCs的增殖、遷移和黏附能力較LPS組不同程度改善，凋亡率降低，隨辛伐他汀濃度增加，該作用增強(qiáng)，辛伐他汀濃度為0.1umol/L EPCs增殖、黏附、遷移功能較LPS組有改善，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.68

14、7、0.501、0.683)，EPCs凋亡率顯著降低(9.2750±0.5961 vs12.632±0.5271，P=0.00)，辛伐他汀濃度為10.0μ mol/L時(shí)，EPCs增殖、黏附、遷移功能，較LPS組均顯著改善(P=0.035，P=002，P=0.011)，其中粘附功能較對(duì)照組也有顯著改善(P=0.039)，不同濃度辛伐他汀與EPCs作用24小時(shí)后再與LPS共孵育，其EPCs凋亡率較LPS組均顯著改善，但仍高于對(duì)照組和辛伐他汀

15、組。
　　 結(jié)論：自臍靜脈血可成功分離內(nèi)皮祖細(xì)胞，并可在體外進(jìn)行傳代培養(yǎng)。LPS與UCBEPCs共孵育，可使UCBEPCs增殖和遷移功能顯著降低，黏附能力下降，凋亡率顯著增加。單純應(yīng)用辛伐他汀(1.0umol/L)與UCBEPCs共孵育，對(duì)UCBEPCs的增殖、粘附、遷移功能及細(xì)胞凋亡無顯著影響。辛伐他汀可以改善LPS導(dǎo)致的EPCs增殖、黏附、遷移功能的降低，在研究范圍內(nèi)改善作用隨濃度增加而增強(qiáng)。提前應(yīng)用辛伐他汀與EPCs共孵育