辛伐他汀對(duì)大鼠急性心肌梗死后內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的：內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是一種能直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它參與了缺血組織的血管新生。組織缺血后，缺血組織釋放缺血相關(guān)因子，刺激骨髓中EPCs動(dòng)員，最終歸巢至缺血組織，參與缺血組織的修復(fù)和血運(yùn)重建。已發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有調(diào)節(jié)循環(huán)中EPCs水平的作用，但機(jī)制尚不完全明確。PI3-K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的凋亡、存活、增殖以及細(xì)胞骨架的變化等活動(dòng)中具有重要的生物學(xué)功能，已證明他汀類藥物具有激活PI3

2、-K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，但這種作用是否與他汀對(duì)EPcs功能影響有關(guān)目前尚不清楚。 本研究擬通過建立大鼠急性心肌梗死模型，觀察辛伐他汀對(duì)大鼠急性心肌梗死后EPCs動(dòng)員的影響；為了進(jìn)一步闡明他汀促進(jìn)EPCs動(dòng)員的分子機(jī)制，我們觀察了辛伐他汀對(duì)大鼠急性心肌梗死后血漿VEGF與AKT水平的影響，并且通過建立骨髓來源的EPCs培養(yǎng)模型，觀察辛伐他汀在體外對(duì)EPCs的AKT、eNOS表達(dá)和VEGF釋放的作用，以及PI3-K/AKT信

3、號(hào)通路阻斷劑對(duì)辛伐他汀的這一作用的影響。 第一部分：辛伐他汀對(duì)大鼠急性心梗后EPCs動(dòng)員的影響 通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，建立大鼠急性心肌梗死模型。術(shù)后當(dāng)天將大鼠隨機(jī)分為辛伐他汀治療組及對(duì)照組，治療組給予辛伐他汀20 mg/kg，每日灌胃一次，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。在術(shù)后0，1，3，5，7，11，15，20天尾靜脈采血，檢測(cè)靜脈血中EPCs的水平。本研究中，我們定義外周血中EPCs為：表達(dá)兩種大鼠干細(xì)胞表面

4、標(biāo)記即CD34和CDl 3 的細(xì)胞群，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+及CD133+的EPCs比例。結(jié)果顯示：1、術(shù)前辛伐他汀干預(yù)組與空白對(duì)照組大鼠外周血中CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異(CD34+：1.1 6±0.34％0 vs 1.14±0.4 0％0，P>0.05；CD133+：0.41±0.1 4％o VS 0.37±0.08％0，P>0.05)。2、在空白對(duì)照組，心梗術(shù)后第一天大鼠外周血中EPCs數(shù)量

5、就較術(shù)前明顯增加(CD34+：5.1 2±3.1 7％o VS 1.1 6±0.34％o，P<0.05；CD13 3+：1.32±0.27％。vs 0.41±0.1 4％o，P<0.05)；術(shù)后第七天EPcs動(dòng)員達(dá)到高峰(CD34+：3.51±2.70‰，CD133+：1.4±0.99‰)；此后EPCs數(shù)量逐漸下降，但術(shù)后20天時(shí)CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)量仍明顯高于術(shù)前(CD34+：1.75±0.5 5％0 vs 1.1 6±0.

6、34％0，P<0.05；CD133+：1.2 3±0.95％。vs 0.41±0.14％o，p<0.05)；提示心肌梗死本身即可誘可骨髓EPCs動(dòng)員。3、辛伐他汀干預(yù)后外周血中CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)量明顯增加，于術(shù)后第三天開始治療組大鼠外周血中CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)量明顯高于空白對(duì)照組(CD34+：4.4 3±1.2 8％0 vs 2.5 2±1.8‰，P<0.05；CD133+：1.49±0.65％0 vs 0.84±

7、0.54％0，P<0.05)；至觀察結(jié)束(心梗術(shù)后20天)時(shí)，治療組大鼠外周血中CD34+及CD133+細(xì)胞數(shù)量仍明顯高于空白對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；提示辛伐他汀能夠促進(jìn)急性心肌梗死后EPCs動(dòng)員。 第二部分：辛伐他汀促進(jìn)EPCs動(dòng)員的機(jī)制探討 既往研究顯示VEGF是促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員的重要因素，而最近研究證實(shí)NO在骨髓EPCs動(dòng)員過程中也具有重要作用。骨髓eNOS激活后，NO釋放增多，促進(jìn)骨髓中基質(zhì)金屬蛋白酶(

8、MMP)-9表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，后者可通過水解骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面的膜型kit配體，使其轉(zhuǎn)化為可溶性的kit配體，解除基質(zhì)細(xì)胞對(duì)EPCs的束縛作用，從而促進(jìn)骨髓EPCs的動(dòng)員。為了進(jìn)一步闡明辛伐他汀促進(jìn)骨髓EPCs動(dòng)員是否由上述機(jī)制介導(dǎo)，我們分別進(jìn)行了動(dòng)物心肌梗死模型的在體研究和骨髓EPCs體外培養(yǎng)研究。在體實(shí)驗(yàn)中，通過結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，建立大鼠心梗模型。術(shù)后當(dāng)天將大鼠隨機(jī)分為辛伐他汀治療組及對(duì)照組，治療組給予辛伐他汀20 mg/k

9、g，每日灌胃一次，對(duì)照組給予生理鹽水灌胃。在術(shù)后0，1，3，5，7，11，1 5，2 0天尾靜脈采血，通過ELISA方法檢測(cè)血漿VEGF及AKT的水平。在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，我們采用密度梯度離心法收集大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，利用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定EPCs表型。收集培養(yǎng)的第2-4代EPCs分成兩組：辛伐他汀干預(yù)組：分別加入不同量的辛伐他汀，使其終濃度依次為0、0.001、0.01、0.1、1 μ mol/L；辛伐他汀加

10、LY294002干預(yù)組：以PI-3K/AKT通路阻斷劑LY294002和EPCs孵育1小時(shí)后再加入不同量的辛伐他汀。24小時(shí)后收集細(xì)胞，利用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中VEGF濃度以及細(xì)胞裂解產(chǎn)物中AKT和eNOS的水平，同時(shí)采用Western blot方法檢測(cè)EPCs的eNOS蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示：1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，在空白對(duì)照組，心梗術(shù)后大鼠外周血中VEGF水平逐漸增高，術(shù)后第七天達(dá)到高峰(81.0±7.35pg/mL vs 5

11、7.6±4.2 3 pg/mL，P<0.05)，此后VEGF水平逐漸下降，但術(shù)后2 0天時(shí)仍明顯高于術(shù)前(64.3±7.34 pg/mL vs 5 7.6±4.2 3pg/mL，P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，辛伐他汀治療組外周血中VEGF水平明顯增加，于術(shù)后第三天開始治療組大鼠外周血中VEGF水平明顯高于對(duì)照組(7 3.1 7±6.31 pg/mL VS 5 6.5±3.78 pg/mL，P<0.05)，至觀察結(jié)束，治療組大鼠外周血

12、中VEGF水平仍明顯高于對(duì)照組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在空白對(duì)照組，心梗術(shù)后大鼠外周血中AKT水平逐漸增高。與空白對(duì)照組比較，辛伐他汀治療后大鼠外周血中AKT水平逐漸增高，于術(shù)后第三天開始治療組大鼠外周血中AKT水平明顯高于對(duì)照組(4 31.5±1 2.1 6 pg/mL vs 39 9.5±1 0.98 pg/mL，P<0.05)，至觀察結(jié)束，治療組大鼠外周血中AKT水平仍明顯高于對(duì)照組(549.3±27.4 pg/mL vs 441

13、.3±11.57 pg/mL，P<0.05)。2、細(xì)胞培養(yǎng)部分，辛伐他汀干預(yù)后明顯增加EPCs的VEGF釋放水平，促進(jìn)EPCs的AKT及eNOS表達(dá)，且這一效應(yīng)隨辛伐他汀濃度增加而增強(qiáng)；PI-3K/AKT通路阻斷劑LY294 002能夠阻斷辛伐他汀對(duì)EPCs的VEGF釋放、AKT及eNOS表達(dá)的上調(diào)作用；提示辛伐他汀通過活化PI3-K/AKT通路促進(jìn)EPCs eNOS的表達(dá)，并增加VEGF的釋放。 結(jié)論： 1、大鼠急性心