辛伐他汀對(duì)炎癥損傷后血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分：兔骨髓源血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)與鑒定 目的：本研究旨在從家兔骨髓中分離、培養(yǎng)、體外擴(kuò)增血管內(nèi)皮祖細(xì)胞 (Endothelial Progenitor Cells，EPCs)，觀察其生長(zhǎng)分化過程并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，建立一整套穩(wěn)定可重復(fù)的培養(yǎng)方法，保證從體外獲得一定數(shù)量的EPCs，從而為EPCs的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。 方法：采用密度梯度離心法從兔骨髓中提取單個(gè)核細(xì)胞，然后用直接貼壁篩選法來分離EPCs，在添

2、加了Singlequotes.的EBM-2培養(yǎng)液中擴(kuò)增培養(yǎng)。光電顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，培養(yǎng)10d后計(jì)算100個(gè)單個(gè)核細(xì)胞所獲取的貼壁細(xì)胞數(shù)并對(duì)培養(yǎng)10d的細(xì)胞進(jìn)行特異性細(xì)胞表面標(biāo)記免疫組織化學(xué)及免疫熒光分析。 結(jié)果：培養(yǎng)4d的細(xì)胞，光電顯微鏡下可見細(xì)胞集落形成，梭形貼壁細(xì)胞從集落中央以放射狀向外周生長(zhǎng)；培養(yǎng)約7～10d，成片生長(zhǎng)的細(xì)胞集落相互連接，呈典型的"鵝卵石"樣外觀；2w左右可見細(xì)胞排列成條索狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)10d后計(jì)算得

3、100個(gè)單個(gè)核細(xì)胞可獲得(38.5±2.5)個(gè)貼壁細(xì)胞，免疫組化顯示貼壁細(xì)胞表達(dá)vWF，VEGFR-2，VE-cadherin，陽(yáng)性率分別為(90±2.1)％，(77±4.1)％，(78.1±8.2)％；免疫熒光顯示貼壁細(xì)胞呈DIL-ac-LDL及FITC-UEA-1雙熒光陽(yáng)性，陽(yáng)性率為(65±4.0)％。 結(jié)論：骨髓中富含EPCs，通過本研究成功建立了一整套骨髓源EPCs的體外分離、擴(kuò)增培養(yǎng)的方法，且操作簡(jiǎn)便具有較好的可重復(fù)性

4、，可得到數(shù)量多、高純度的EPCs。 第二部分：辛伐他汀對(duì)炎癥損傷后血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用 目的：研究炎癥因子--腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激對(duì)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)產(chǎn)生E-選擇素及內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活力的影響，并觀察不同濃度辛伐他汀干預(yù)后對(duì)上述變化所起的作用。 方法：體外培養(yǎng)兔骨髓源血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，用不同濃度TNF-α(1、10、25、50ng/ml)刺激24h；50ng/ml TNF-α刺

5、激細(xì)胞0.5h后用不同濃度辛伐他汀(0、0.1、1.0、10μmol/L)干預(yù)24h，收集上清；用ELISA的方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中可溶性E一選擇素的濃度，用化學(xué)比色法測(cè)定上清液eNOS活力。 結(jié)果：在TNF-α的刺激下內(nèi)皮祖細(xì)胞產(chǎn)生E-選擇素增加同時(shí)eNOS活力降低(P<0.05)，變化的量和TNF-α的濃度呈相關(guān)性；而加入辛伐他汀后E一選擇素明顯下降，eNOS活力增大(P<0.05)并且增大的程度與辛伐他汀呈明顯的濃度依賴性。