HGF基因對血管內(nèi)皮祖細胞增殖的影響.pdf

1、目的： 離體條件下從大鼠骨髓中分離出單個核細胞，使用特殊的培養(yǎng)基使其向內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化生長，并將HGF基因轉染原代培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮祖細胞，觀察轉染后細胞上清液中HGF的表達及HGF基因對原代培養(yǎng)血管內(nèi)皮祖細胞增殖的影響。 方法： 1.取4-6周齡Wistar大鼠（120-150g）雙下肢股骨及脛骨骨髓，利用密度梯度離心法分離單個核細胞，并使用內(nèi)

2、皮系專用培養(yǎng)液EGM-2MV誘導培養(yǎng)，使其分化為血管內(nèi)皮祖細胞。通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的生長情況，通過熒光顯微鏡觀察細胞攝取DiL-acLDL、結合FITC-UEA-1，從功能角度鑒定細胞，并通過流式細胞術動態(tài)測定細胞表面抗原CD133、flk-1、VE-cadherin（CD144）及CD31進一步鑒定所培養(yǎng)細胞為血管內(nèi)皮祖細胞。 2.提取和擴增pIRES2-EGFP-HGF質(zhì)粒，以陽離子脂質(zhì)體（Lipofectami

3、neTM2000）介導pIRES2-EGFF-HGF質(zhì)粒轉染血管內(nèi)皮祖細胞并計算轉染效率；采用ELISA法檢測轉染后HGF蛋白的表達情況；用MTT法檢測HGF基因對EPCs增殖的促進作用。 結果： 1.成功分離和培養(yǎng)出大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞，并通過細胞功能檢測和流式細胞術檢測表面抗原來鑒定。 2.成功將HGF基因轉染大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達；在HGF轉染組細胞培養(yǎng)上清中檢測到HG

4、F的表達，1天、2天、3天、5天、7天濃度分別為638.48±66.91、1230.33±96.35、2097.88±138.32、4017.20±169.92、1869.87±101.22（pg/ml），而空載質(zhì)粒組和陰性對照組沒有檢測出HGF的表達；轉染后HGF基因對原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮祖細胞生長有顯著的促增殖作用，轉染5天和7天，轉染組血管內(nèi)皮祖細胞增殖明顯加快，與空載質(zhì)粒組及陰性對照組相比均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。