轉(zhuǎn)染BMP-2基因的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的構(gòu)建.pdf

1、[目的]
　　 通過克隆、構(gòu)建pEGFP-BMP-2表達(dá)質(zhì)粒載體并觀察BMP-2基因在EPCs(endothelial progenitor cells，血管內(nèi)皮祖細(xì)胞)中的表達(dá)與分布，旨在研究EPCs的特性及修飾后的特性，為骨組織工程技術(shù)成為骨缺損修復(fù)治療方法提供可靠的基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 采用密度梯度法分離兔骨髓的單個核細(xì)胞(MNCs)，采用專用的EGM2完全培養(yǎng)基對單個核細(xì)胞進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，動態(tài)觀

2、察細(xì)胞生長過程，并應(yīng)用細(xì)胞熒光化學(xué)法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)記(CD34、CD133和VEGFR2)并用DAPI染細(xì)胞核法鑒定；采用RT-PCR法從大鼠胃組織中擴增BMP-2cDNA編碼區(qū)，并將其重組于pEGFP-C3中，經(jīng)酶切、測序分析鑒定后，將該重組質(zhì)粒載體通過Lipofectamine介導(dǎo)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入EPCs細(xì)胞內(nèi)并篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞；熒光顯微鏡觀察BMP-2蛋白在EPCs內(nèi)表達(dá)與分布。
　　 [結(jié)果]
　

3、　 細(xì)胞熒光化學(xué)法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、CD133和VEGFR2均為陽性，證明分離、培養(yǎng)出的細(xì)胞為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞；pEGFP-C3-BMP-2表達(dá)質(zhì)粒載體經(jīng)雙酶切鑒定、測序分析證實其構(gòu)建成功；熒光顯微鏡下，pEGFP-C3-BMP-2表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的EPCs細(xì)胞中綠色熒光彌散分布于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)(熒光照片似乎細(xì)胞核中也表達(dá))，其對照組則綠色熒光未見分布于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。
　　 [結(jié)論]
　　 分離與培