高糖對(duì)BMP-2、IGF-Ⅰ基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSC增殖的影響.pdf

1、背景：骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)體自身修復(fù)過程，需要多種生長(zhǎng)因子參與。臨床上糖尿病合并骨折患者很常見，延遲愈合或不愈合發(fā)生率高，是臨床醫(yī)師面臨的棘手問題。研究認(rèn)為糖尿病骨折愈合過程中血清及局部骨痂組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（Bone morphogenetic protein-2，BMP-2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(Insulin-like growth factor-1，IGF-I)含量減少是導(dǎo)致骨折延遲愈合、不愈合的原因之一。隨著干細(xì)胞工

2、程和組織工程的研究進(jìn)展，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞已成為研究和治療多種骨科疾病及其合并癥的一種重要方法。BMP-2、IGF-I均具有促進(jìn)BMSC增殖及向成骨細(xì)胞分化的作用，而關(guān)于兩者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)BMSC增殖及分化效應(yīng)尚缺乏系統(tǒng)研究。
　　 目的：高糖環(huán)境下通過測(cè)定BMP-2、IGF-I基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSC后，目的蛋白表達(dá)情況及BMSC的增殖情況，進(jìn)一步了解基因轉(zhuǎn)染BMSC的生物學(xué)特性，為構(gòu)建新型組織工程骨種子細(xì)胞提供思路，從而為臨床上應(yīng)用BM

3、SC移植治療糖尿病骨折不愈合、延遲愈合提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：用Ad-BMP-2和Ad-IGF-I轉(zhuǎn)染大鼠BMSC，按轉(zhuǎn)染情況分為5組：A組：未轉(zhuǎn)染組；B組：轉(zhuǎn)染空載體組；C組：轉(zhuǎn)染BMP-2組；D組：轉(zhuǎn)染IGF-I組；E組：BMP-2加IGF-I共轉(zhuǎn)染組。分別于轉(zhuǎn)染處理后24h、48h、72h、96h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果；不同時(shí)間點(diǎn)觀察各組大鼠BMSC的形態(tài)變化；利用蛋白印跡法(Western blotting)檢測(cè)轉(zhuǎn)

4、染后24h、48h、72h各組細(xì)胞BMP-2和IGFI的表達(dá)情況。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法及流式細(xì)胞儀，觀察大鼠BMSC的生長(zhǎng)及增殖情況。利用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：(1)基因轉(zhuǎn)染組（C、D、E組）與未轉(zhuǎn)染組及空載體組比較，轉(zhuǎn)染處理后初期，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，基因轉(zhuǎn)染組多角形細(xì)胞增多。(2)熒光顯微鏡下觀察到基因轉(zhuǎn)染組大部分細(xì)胞呈現(xiàn)綠

5、色熒光，Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染大鼠BMSC后48h時(shí)最強(qiáng)，Ad-IGF-I轉(zhuǎn)染大鼠BMSC后72h時(shí)最強(qiáng)，Ad-BMP-2-IGF-I轉(zhuǎn)染大鼠BMSC后72h時(shí)最強(qiáng)。轉(zhuǎn)染率均高達(dá)90％以上。(3)蛋白印跡法檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中有BMP-2和IGF-I蛋白表達(dá)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)目的蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)。(4)生長(zhǎng)曲線、MTT法及流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示第5天各組BMSC增殖能力趨于達(dá)到高峰，其中E組增殖能力最強(qiáng)(P＜0.05)。5d光吸收值：A-E組分別為

6、0.324±0.027，0.319±0.017，0.622±0.028，0.626±0.020，0.778±0.031。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示A-E組細(xì)胞處于增殖期的比重分別為23.92±3.07,23.51±2.11,34.37±6.85,35.04±1.45,42.56±1.15。
　　 結(jié)論：高糖環(huán)境下在腺病毒載體介導(dǎo)下BMP-2、IGF-I基因轉(zhuǎn)染BMSC是可行的，經(jīng)BMP-2、IGF-I基因轉(zhuǎn)染的BMSC能夠穩(wěn)定表達(dá)外源性