BMP-2基因轉染ADSCs復合CTCP成骨及修復頜骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 1、探索SD大鼠脂肪組織來源干細胞(adiposederivedstemcells,ADSCs)的體外培養(yǎng)方法，觀察其體外增殖能力及生物學特性，對細胞表面干細胞相關標志進行鑒定，為脂肪干細胞的進一步研究奠定基礎。 2、對原代及第3代ADSCs向脂肪細胞、成骨細胞、成脂肪細胞定向誘導，觀察其多向分化潛能，并探討其體外成骨能力，為ADSCs作為骨組織工程種子細胞提供理論依據(jù)。 3、擴增、純化本實驗室所構建的含重

2、組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(humanbonemorphogeneticprotein,hBMP-2)基因和含綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因的重組腺病毒表達載體(Ad-hBMP-2，Ad-GFP)，并測定其滴度；研究ADSCs經基因轉染后生物學行為的變化和目的基因的表達，應用Ad-GFP轉染細胞，測定腺病毒轉染效率。 4、探索以Ad-BMP-2轉染的ADSCs作種子細胞，并以殼聚糖—磷酸三

3、鈣(CTCP)為支架材料，構建組織工程化骨的可行性，觀察在無免疫力的裸鼠體內成骨情況，和在有免疫力的SD大鼠體內修復下頜骨缺損的效果。 方法 1、從3周齡SD大鼠腹股溝脂肪墊分離出脂肪組織，通過Ⅰ型膠原酶消化法獲取原代ADSCs，適時傳代。逐日倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長特征;研究其增殖過程，MTT法繪制出生長曲線；采用免疫組化、免疫熒光流式細胞術對細胞表面干細胞相關標志進行鑒定。應用透射電鏡觀察其超微結構。 2

4、、對原代及第3代ADSCs向成脂肪細胞、成骨細胞、成神經細胞分別應用成脂肪誘導液，成骨誘導液，成神經細胞誘導液定向誘導，觀察其多向分化潛能。并分進行油紅O染色，PPARr免疫組化染色進行脂肪細胞鑒定；應用堿性磷酸酶染色、OC/Ⅰ型膠原免疫組化、VonKossa染色鑒定成骨特性。應用NSE/GFAP免疫細胞化學染色鑒定成神經細胞情況。 3、將本實驗室構建的Ad-BMP-2/Ad-GFP用人胚腎細胞(HEK293細胞)擴增、純化并進

5、行滴度測定；通過形態(tài)學觀察、透射電鏡觀察，生長曲線的測定、堿性磷酸酶染色、體外礦化實驗和RT-PCR、Western-blotting檢測，觀察脂肪源性間充質干細胞轉染Ad-hBMP-2后生物學行為的變化和目的基因hBMP-2的表達。ADSCs轉染Ad-GFP后12h，應用熒光顯微鏡觀測，測定腺病毒轉染效率，并觀測轉染Ad-GFP的ADSCs傳代后綠色熒光蛋白的表達情況。 4、轉染目的基因的ADSCs與未轉染的ADSCs對照組細

6、胞分別以5×107cell/mL的密度與CTCP支架材料復合，構建組織工程化骨，體外進行掃描電鏡觀察，確定支架的組織相容性。植入裸鼠體內，6周后進行組織學新骨成骨面積分析。 將20只成年SD大白鼠，隨機分為4組，前3組為治療組，每組6只，于一側下頜骨體部制造5mm×5mm的全厚下頜骨缺損模型，分別植入A組：hBMP-2基因修飾的組織工程化骨；B組：未經基因修飾的組織工程化骨和C組單純CTCP材料，D組2只，未植入任何材料作為空白

7、對照。分別于術后第4周、第12周各處死一半實驗動物，獲取標本并行大體觀察、X線檢查、組織學檢查、免疫組化測試，并應用單因素方差分析對各組不同時期的新生骨量進行了統(tǒng)計學比較。 結果 1、從大鼠脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs，形態(tài)類似成纖維細胞，具有良好的體外增殖能力，且長期傳代仍能保持穩(wěn)定的增殖力。免疫組化及流式細胞儀檢測顯示：培養(yǎng)第3代脂肪干細胞CD13、CD44表達率維持較高水平，而不表達CD34、CD106和HLA-

8、DR。 2、原代及第3代ADSCs體外均能定向誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞和神經細胞表型的細胞。ADSCs在成骨誘導7d、14d堿性磷酸酶染色呈強陽性，VonKossa染色出現(xiàn)鈣結節(jié)，OC、Ⅰ型膠原免疫細胞化學染色陽性，表現(xiàn)成骨細胞特性。成脂誘導14d細胞體積變大，胞內出現(xiàn)脂肪滴，油紅O染色紅色表達，PPARr免疫組化染色核內有黃色顆粒；成神經誘導5h后，免疫組化染色NSE陽性表達，GFAP陰性表達。 3、體外轉染ADS

9、Cs后發(fā)現(xiàn)：細胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變；生長曲線表明ADSCs轉染Ad-hBMP-2后增殖能力未見明顯降低；透射電鏡觀察細胞內內質網、線粒體等細胞器變豐富；堿性磷酸酶染色見大部細胞呈現(xiàn)陽性，著色以細胞核為中心沿細胞內質網分布；經VonKossa染色見有黑色的礦化結節(jié)；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉染后24h即有mRNA表達、2周明顯、4周仍有表達；轉染后第3天、2周、4周，上清液Western-blotting檢測可測到陽性蛋白電泳帶。Ad-GFP

10、轉染12小時后即可檢測到綠色熒光蛋白表達；轉染2天后平均轉染效率為95﹪，傳至5代后依然可檢測到綠色熒光蛋白表達。 4、ADSCs可以在CTCP支架網孔內表面貼壁生長，組織相容性好，光鏡和掃描電鏡下均能發(fā)現(xiàn)支架材料爬滿細胞。 裸鼠體內的背部皮下和大腿肌肉內內植入6周后，轉基因組復合材料體積包滿，質地較硬；而另兩組體積變小，質地較軟。轉基因組X線檢查明顯的骨組織影；另兩組則不明顯。組織病理示基因修飾的實驗組新骨形成的面積大

11、于對照組(P＜0.05)。基因修飾組病理免疫組化可檢測到BMP-2陽性表達。 SD大白鼠下頜骨缺損的修復結果： X線檢查：術后4周A組骨缺損區(qū)域可見有呈絮狀或條索狀密度增高影；B、C組缺損區(qū)亦有云霧狀高密度影；D組骨缺損區(qū)界線清楚，未見高密度影。術后12周，A組缺損處密度與周圍骨質基本相似；B、C組缺損處密度略低于周圍骨組織；C組仍有約3mm左右的矩形缺損。 組織學檢查：4周時，A組間隙內有大量骨細胞、軟骨細胞及

12、類骨質。B、C組有較少量骨細胞及骨樣組織形成；D組缺損處見肌肉和纖維結締組織。成骨面積分析A組大于B、C兩組(P＜0.05)；B、C兩組之間無顯著差異。12周時，A組材料大部降解，其間新生骨、軟骨樣組織更為明顯;B、C組見較多新骨組織形成，但骨密度低；D組缺損處依然見肌肉和纖維結締組織，空白組缺損未能修復。 結論 1、大鼠脂肪組織中含有大量ADSCs，且易于分離培養(yǎng)，體外擴增迅速，長期傳代仍能保持穩(wěn)定的增殖力。

13、2、ADSCs具有向脂肪細胞、成骨細胞、神經細胞等多向分化潛能，有可能作為多種組織工程的種子細胞。 3、體外實驗證實：我們所構建擴增并純化的腺病毒載體可高效感染脂肪組織來源的干細胞，感染后細胞依然保持較旺盛的增殖能力，成骨能力明顯。且能夠成功地持續(xù)表達分泌型hBMP-2，為后續(xù)hBMP-2基因治療的應用研究奠定了基礎。 4、采用二次冷凍干燥法制成的殼聚糖-磷酸三鈣(CTCP)復合材料具有適宜的三維多孔結構，脂肪基質干細胞