高糖對(duì)內(nèi)皮-成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　血管鈣化(vascualr calcification，VC)是糖尿病(DM）常見(jiàn)的血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致DM患者心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著增加的重要危險(xiǎn)因素。高糖作為DM的特征性表現(xiàn)，是DM心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明，高糖在VC的發(fā)生，發(fā)展中發(fā)揮重要作用。然而，高糖在這個(gè)過(guò)程中如何發(fā)揮作用及相應(yīng)的具體機(jī)制尚不清楚。既往研究表明，高糖能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞和

2、血管內(nèi)皮周細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，獲得成骨樣細(xì)胞表型進(jìn)而形成骨基質(zhì)，促進(jìn)VC形成。隨著研究深入，最近研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EndMT)，獲得多能干細(xì)胞表型，進(jìn)而在一定條件誘導(dǎo)下成為成骨細(xì)胞參與血管中膜鈣化(MAC)的形成。而且，我們?cè)谇捌隗w內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心臟微血管早期可發(fā)生EndMT，高糖可以誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAECs)發(fā)生EndMT。因而，本研究擬在前期的研究基礎(chǔ)上，通過(guò)體外HAECs培養(yǎng)，利用形態(tài)

3、學(xué)，分子生物學(xué)等檢測(cè)手段，著重探討高糖促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)EndMT向成骨細(xì)胞分化，并探討其可能的信號(hào)傳導(dǎo)路徑，以闡明糖尿病血管鈣化形成的新機(jī)制，為臨床早期防治糖尿病VC提供新的思路。
　　方法:
　　本研究共分為兩部分，第一部分實(shí)驗(yàn)著重探討在高糖環(huán)境中，HAECs是否通過(guò)EndMT獲得干細(xì)胞樣表型，繼而轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞沉積于血管中膜，參與血管中膜鈣化的形成和進(jìn)展及參與此過(guò)程的分子機(jī)制。因此，在第一部分實(shí)驗(yàn)中:HAECs被分成3組

4、:正常葡萄糖濃度組(NG，5.5mM)、高濃度葡萄糖組(HG，30mM)和等滲甘露醇組(MN，5.5mM葡萄糖+24.5mM甘露醇)，干預(yù)48小時(shí)后，Westem blot檢測(cè)細(xì)胞CD31，F(xiàn)SP1和a-SMA蛋白的表達(dá)。免疫熒光染色，RT-PCR及Westem blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和STRO-1的表達(dá)情況。激光共聚焦顯微鏡觀察CD31和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(FSP1)在HAECs細(xì)胞的表達(dá)共定位情況及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

5、。其后對(duì)HG刺激的HAECs予以成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MODS)誘導(dǎo)分化1周。Westem blot檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)，并使用茜素紅(s)染色鑒定鈣質(zhì)沉積，BCIP/NBT堿性磷酸酶染色;
　　第二部分實(shí)驗(yàn)著重探討IL-1β在高糖誘導(dǎo)的HAECs表型轉(zhuǎn)變中的作用，及IL-1β產(chǎn)生的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，在第二部分實(shí)驗(yàn)中:HAECs分別予以如下干預(yù):NG，HG，佛波酯30 nM(PKCβ激活劑，PMA)，PMA+LY31761

6、50.3 uM(PKCβ選擇性抑制劑)，HG+LY317615(0.3 uM)，IL-1β(10 ng/ml)，HG+IL-1β(10 ng/ml)，HG+抗IL-1β抗體(1000 ng/ml)或HG+IL-1βsiRNA。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β濃度。RT-PCR檢測(cè)PKCβ和IL-1β mRNA水平。Western blot檢測(cè)FSP1，a-SMA，CD31及PKCβ和IL-1β蛋白表達(dá)水平。激光共聚

7、焦顯微鏡觀察CD31和FSP1在HAECs的共表達(dá)情況及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。
　　結(jié)果:
　　第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:高糖干預(yù)后，HAECs的CD31蛋白表達(dá)減少，F(xiàn)SP1和a-SMA表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，且間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、STRO-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴(lài)性增加。免疫熒光顯示間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、STRO-1表達(dá)增加。另外，HG組的Notch信號(hào)蛋白亦表達(dá)增加。激光共聚焦顯

8、微鏡可見(jiàn)CD31和FSP1表達(dá)重疊部分，部分細(xì)胞呈紡錘樣改變并失去CD31染色。透射電鏡可見(jiàn)細(xì)胞微絲成團(tuán)狀明顯增多。經(jīng)成骨細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化1周后，HG組細(xì)胞Cbfal，Osterix蛋白表達(dá)水平顯著高于NG組(P＜0.05）。細(xì)胞茜素紅(s)染色和堿性磷酸酶染色呈現(xiàn)陽(yáng)性。
　　第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與NG組比較，HG刺激HAECs導(dǎo)致PKCβ和IL-β mRNA和蛋白表達(dá)呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性增加。同時(shí)相應(yīng)的PMA干預(yù)亦可導(dǎo)致HAE

9、Cs表達(dá)PKCβ和IL-β增加，并能夠被LY317615抑制（P＜0.05）。外源性IL-1β刺激可導(dǎo)致HAECs的FSP1和a-SMA的mRNA表達(dá)呈濃度依賴(lài)性增加（P＜0.05），CD31表達(dá)減少。相較單獨(dú)的HG或IL-β干預(yù)組，HG+IL-1β具有協(xié)同效應(yīng)，表現(xiàn)為CD31表達(dá)減少(P＜0.05)及FSP1和a-SMA的蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.01）?？笽L-1β抗體或IL-1β siRNA干預(yù)均可以逆轉(zhuǎn)上述分子學(xué)改變（P＜0.0

10、5）。同時(shí)激光共聚焦顯微鏡及透射電鏡觀察顯示CD31和FSP1的共表達(dá)減弱，細(xì)胞內(nèi)部微絲表達(dá)減少。
　　結(jié)論:
　　1)本研究表明，高糖狀態(tài)下，激活的Notch信號(hào)促進(jìn)內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而獲得多能干細(xì)胞表型，并在合適的誘導(dǎo)環(huán)境下能夠分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨樣物質(zhì)形成。
　　2) IL-1β介導(dǎo)了高糖誘導(dǎo)的HAECs表型的轉(zhuǎn)變，而且這種轉(zhuǎn)變可以通過(guò)阻斷IL-1β產(chǎn)生而相應(yīng)的減弱。
　　3) PKCβ的激活可能是高