microRNA-200c在高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)由于具有操作簡單、血流動力學(xué)穩(wěn)定和有利于保護(hù)殘腎功能等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛運(yùn)用于終末期腎臟疾病(end stage renal disease，ESRD)患者的治療，然而PD的相關(guān)并發(fā)癥影響著ESRD患者的治療效果和預(yù)后，其中透析相關(guān)性腹膜纖維化(peritoneal fibrosis，PF)導(dǎo)致的超濾衰竭(ultrafiltration failure，UFF)

2、是持續(xù)性非臥床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)患者不能持續(xù)治療的主要原因。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)和高糖介導(dǎo)的PF發(fā)病機(jī)制一直是國內(nèi)外PD領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腹膜纖維化發(fā)生的過程中起著關(guān)鍵的作用

3、，它被認(rèn)為是腹膜纖維化的起始環(huán)節(jié)和可逆階段。
　　微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中長度為21-24個核苷酸的非編碼小分子RNA，其通過“種子”序列與靶基因mRNA3'端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)特異性結(jié)合，導(dǎo)致蛋白翻譯受到抑制或靶mRNA降解，從而影響調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。miRNA-200家族是近年來研究的熱點(diǎn)，尤其miRN

4、A-200家族與EMT密切相關(guān)，miRNA-200通過調(diào)控EMT過程，對胚胎的發(fā)育、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及器官纖維化均起著重要作用。盡管miRNA-200c在腹膜間皮細(xì)胞上是否有表達(dá)以及其在腹膜間皮細(xì)胞EMT和腹膜纖維化中的作用國內(nèi)外尚未見報道。但基于以上分析，我們認(rèn)為，microRNA-200c可能參與了調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞EMT及腹膜纖維化的過程，并且調(diào)節(jié)miRNA-200c的表達(dá)水平可能影響腹膜間皮細(xì)胞的EMT過程。
　　第一章，腹膜

5、透析患者腹膜透析流出液細(xì)胞中microRNA-200c的表達(dá)及與轉(zhuǎn)分化的關(guān)系
　　目的:檢測腹膜透析患者腹膜透析流出液細(xì)胞中microRNA-200c的表達(dá)及EMT發(fā)生情況，初步探討microRNA-200c與腹膜間皮細(xì)胞EMT的關(guān)系。
　　方法:隨機(jī)選取新開管CAPD患者13人，PD時間≥1年者14人，分離培養(yǎng)并鑒定流出液細(xì)胞;通過realtime PCR檢測流出液細(xì)胞中microRNA-200c的表達(dá);利用realtim

6、e PCR及western blot分別檢測流出液細(xì)胞中E-鈣黏素(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、膠原蛋白Ⅰ(Collagen-Ⅰ， Col-Ⅰ)的mRNA及蛋白表達(dá)。并對microRNA-200c與E-cadherin、vimentin、FN、Col-1進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:腹透流出液細(xì)胞為人腹膜間皮細(xì)胞(human peritonealmesothel

7、ial cells，HPMC)，不同透齡患者流出液細(xì)胞存在形態(tài)學(xué)改變。microRNA-200c在PD≥1年組中的表達(dá)較新開管組明顯下降。PD≥1年組流出液細(xì)胞E-cadherin mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于新開管組，而vimentin、 Col-1及FN mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于新開管組。且microRNA-200c與E-cadherin呈正相關(guān)，與vimentin、FN、Col-Ⅰ呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:腹膜透析患者腹透流出液

8、細(xì)胞經(jīng)證實(shí)為人HPMC，并表達(dá)microRNA-200c;隨PD時間的延長，microRNA-200c表達(dá)呈顯著降低并同時伴有EMT的發(fā)生和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的沉積，提示microRNA-200c可能與腹膜纖維化有關(guān)。
　　第二章，microRNA-200c在高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞EMT中的作用
　　目的:探討microRNA-200c在高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞株（HMrSV5）

9、EMT中的作用。
　　方法:以含5.6mM葡萄糖的普通培養(yǎng)基作為對照組，HMrSV5細(xì)胞被給予不同濃度（30，60，90mM D-葡萄糖）高糖刺激，刺激時間為24小時，通過realtime PCR檢測HMrSV5細(xì)胞microRNA-200c的表達(dá);利用realtime PCR及western blot分別檢測HMrSV5細(xì)胞中E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN mRNA及蛋白的表達(dá)。在不同時間點(diǎn)(0h，12

10、h，24h，48h)用90mM D-葡萄糖處理HMrSV5細(xì)胞后，通過realtime PCR檢測HMrSV5細(xì)胞microRNA-200c的表達(dá);通過realtimePCR及western blot分別檢測HMrSV5細(xì)胞中E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN mRNA及蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染microRNA-200c的模擬物(mimics)及陰性對照miR-200c mimics negative control，再予

11、高糖刺激，通過細(xì)胞免疫熒光、realtime PCR及western blot檢測HMrSV5細(xì)胞E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:與正常對照組相比較，高糖抑制HMrSV5細(xì)胞E-cadherinmRNA及蛋白表達(dá)水平，且呈時間及濃度依賴性;同時高糖促進(jìn)vimentin、FN及Col-Ⅰ mRNA及蛋白表達(dá)水平，也呈時間及濃度依賴性。與正常對照組比較，高糖抑制HMrSV5細(xì)胞micro

12、RNA-200c表達(dá)，呈時間及濃度依賴性。過表達(dá)microRNA-200c可以使高糖刺激組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，vimentin、Col-Ⅰ、FN mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào);但轉(zhuǎn)染miR-200c mimics negative control后對高糖誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞E-cadherin、Col-Ⅰ、vimentin、FN的表達(dá)變化無明顯影響。
　　結(jié)論:高糖誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞發(fā)生EMT;高糖誘導(dǎo)HM

13、rSV5細(xì)胞microRNA-200c表達(dá)下調(diào);上調(diào)microRNA-200c可逆轉(zhuǎn)HMrSV5細(xì)胞EMT，提示microRNA-200c抑制高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞EMT。
　　第三章，microRNA-200c通過調(diào)節(jié)ZEB1參與高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化
　　目的:闡明microRNA-200c參與調(diào)控高糖誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞EMT的可能機(jī)制，為靶向microRNA-200c防治腹膜纖維化提供理論依據(jù)。
　

14、　方法:采用realtime PCR及western blot檢測不同透析時間PD患者腹膜透析流出液分離培養(yǎng)的HPMC中ZEBl mRNA及蛋白的表達(dá);用不同濃度（30，60，90mM D-葡萄糖）高糖及在不同時間點(diǎn)(0h，12h，24h，48h)用90mM D-葡萄糖刺激HMrSV5細(xì)胞后，通過realtime PCR及western blot檢測HMrSV5細(xì)胞中ZEB1的表達(dá);轉(zhuǎn)染microRNA-200cmimics及miR-2

15、00c mimics negative control后，通過細(xì)胞免疫熒光、realtime PCR及western blot檢測高糖刺激下HMrSV5細(xì)胞ZEB1mRNA及蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:PD≥1年組與新開管組比較，腹膜透析流出液分離培養(yǎng)的HMPC中ZEB1的表達(dá)增高;與正常對照組比較，高糖促進(jìn)HMrSV5細(xì)胞ZEB1 mRNA及蛋白表達(dá)，且呈時間和濃度依賴性上調(diào)。過表達(dá)microRNA-200c可以使ZEB1 mRN

16、A和蛋白水平下調(diào);轉(zhuǎn)染miR-200cmimics negative control后對高糖誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞ZEB1的表達(dá)變化無明顯影響。
　　結(jié)論:長期PD患者腹透流出液分離培養(yǎng)的HPMC ZEB1表達(dá)上調(diào);高糖促進(jìn)HMrSV5細(xì)胞ZEB1 mRNA及蛋白表達(dá)，miRNA-200c過表達(dá)抑制高糖組HMrSV5細(xì)胞中ZEB1的表達(dá)，提示miRNA-200c通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)ZEB1，影響E-cadherin等的表達(dá)，從而參與