Galectin-1在高糖腹透液誘導人腹膜間皮細胞轉分化中的作用.pdf

1、背景：腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是腎臟替代治療三種方式之一。超濾衰竭(Ultrafiltration Failure,UFF)是腹膜透析病人退出治療的最主要的原因之一。已有大量研究證實，高濃度的葡萄糖腹透液引起腹膜形態(tài)和功能的改變，腹膜細胞的損傷和修復甚至細胞向間充質細胞轉分化(Epithelial-to-mesenchymal Transition,EMT)，最終導致腹膜纖維化(Peritoneal fi

2、brosis,PF)和超濾衰竭的發(fā)生。但目前關于腹膜纖維化的分子機制仍未完全闡明。
　　 Galectin-1是第一個被報道的哺乳動物半乳糖凝集素，參與細胞的粘附、增殖、分化、凋亡，炎癥反應等多種生理、病理過程，并在免疫系統(tǒng)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們以往的研究通過蛋白組學方法發(fā)現(xiàn)高糖刺激腹膜間皮細胞后galectin-1表達明顯上調，推測galectin-1可能在腹膜纖維化某一環(huán)節(jié)起作用。最新的研究報道發(fā)現(xiàn)galect

3、in-1通過阻斷TGF-β/Smad通路抑制腎小管上皮細胞膠原Ⅰ的表達，但galectin-1在高糖腹透液誘導體外腹膜間皮細胞EMT的表達及與EMT的關系國內外尚未見報道。
　　 vimentin和zo-1是常用的EMT相關的指標。波形蛋白(vimentin)是間質細胞中最主要的中間纖維，它存在于中胚層起源的細胞中，如成纖維細胞、內皮細胞和白細胞等，并與微管、微絲共同形成了一個細胞支架網絡而維持細胞完整性。緊密連接相關蛋白1(z

4、onulaoccluden-1,ZO-1)則是組成緊密連接的支架，是維持血管和腹透液兩側滲透壓梯度的相關結構。Vimentin的表達增加和zo-1的表達丟失提示細胞可能發(fā)生EMT。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(doublestranded RNA,DsRNA)誘導與之同源的mRNA降解，從而引發(fā)的轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene Silenc

5、ing,PTGS)，目前已成功用于基因功能和信號傳遞系統(tǒng)上下游分子相互關系的研究，有可能成為繼反義核酸，核酶之后的又一新手段。
　　 第一章高糖腹透液對腹膜間皮細胞galectin-1表達的影響
　　 目的：通過觀察不同濃度葡萄糖腹透液對腹膜間皮細胞(HPMC)galectin-1及EMT相關指標vimentin、zo-1表達的影響，初步探討galectin-1與EMT的關系。
　　 方法：以人腹膜間皮細胞株為研

6、究對象，隨機分為4組：正常對照組(5.5mmol/L)，1.5％PDS組，2.5％PDS組及4.25％PDS組。采用實時定量PCR(Real-time PCR)測定galectin-1，vimentin和zo-1mRNA水平的表達；采用蛋白印跡(Westem-blot)方法，測定galectin-1，vimentin和zo-1蛋白水平的表達。分析galectin-1與Vimentin，zo-1表達的相關性。
　　 結果：

7、　　 (1)正常培養(yǎng)條件下，HPMC表達galectin-1，僅表達少量的vimentin和一定量的zo-1。
　　 (2)4.25％PDS刺激HPMC不同時間，galectin-1蛋白表達量逐漸增高，12h，24h，48h galectin-1的蛋白表達量分別為對照組的1.09倍，1.22倍和1.42倍，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。72h galectin-1的蛋白表達量較前稍下降，為對照組的1.37倍，與對照組比較有統(tǒng)

8、計學差異(P＜0.05)。
　　 (3)不同濃度葡萄糖腹透液刺激HPMC galectin-1 mRNA和蛋白水平的表達逐漸增高，呈濃度依賴性。Galectin-1mRNA表達量分別為對照組的1.22倍，1.535倍和2.34倍(P＜0.05)。1.5％PDS組，2.5％PDS組，4.25％PDS組galectin-1的蛋白表達量分別為對照組的1.48倍，2.01倍和2.38倍，與對照組相比較，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。<

9、br>　　 (4)高糖PDS刺激HPMC48h后，vimentin mRNA和蛋白水平表達顯著上調，呈濃度依賴性。與對照組相比較，vimentin mRNA的表達分別為對照組的1.16倍，1.27倍和1.69倍(P＜0.05)。vimentin蛋白表達量分別為對照組的1.28倍，1.51倍1.92倍(P＜0.05)。
　　 (5)高糖PDS刺激HPMC48h后，zo-1 mRNA和蛋白水平表達顯著下調，呈濃度依賴性。與對照組相

10、比較，zo-1 mRNA的表達分別為對照的77％，43％(P＜0.05)和20％(P＜0.05)。zo-1蛋白表達量分別為對照組的88％，52％(P＜0.05)和40％(P＜0.05)。
　　 (6)galectin-1 mRNA表達與vimentin mRNA表達呈正相關(r＝0.864,P＜0.05)，與zo-1 mRNA表達呈相關(r＝-0.604,P＜0.05)；galectin-1蛋白水平表達與vimentin蛋白水平

11、表達呈正相關(r＝0.917,P＜0.05)；galectin-1蛋白水平表達與zo-1蛋白表達呈負相關(r＝0.869,P＜0.05)
　　 結論：
　　 (1)galectin-1在人腹膜間皮細胞(HPMCs)有表達，高糖腹透液能上調galectin-1的表達，且呈濃度和時間依賴性。
　　 (2)高糖腹透液能誘導HPMCs發(fā)生轉分化。
　　 (3)galectin-1與高糖腹透液誘導HPMCs轉分化相

12、關。
　　 第二章 galectin-1 siRNA對人腹膜間皮細胞轉分化的影響
　　 目的：轉染galectin-1 siRNA抑制人腹膜間皮細胞galectin-1的表達，檢測vimentin、zo-1的表達，觀察galectin-1siRNA能否抑制高糖腹透液誘導的HPMCs轉分化。
　　 方法：以脂質體法轉染siRNA至HPMC，把HPMC分為3組：正常對照組（未轉染HPMC＋5.5mmol/L葡萄糖），

13、高糖組（未轉染HPMC＋4.25％高糖PDS刺激組）和轉染組（轉染galectin-1 siRNA的HPMC＋1.25％高糖PDS刺激）。采用實時定量PCR(Real-time PCR)測定galectin-1，vimentin和zo-1mRNA水平的表達；采用蛋白印跡(Westem-blot)方法，測定galectin-1，vimentin和zo-1蛋白水平的表達。
　　 結果：
　　 (1)4.25％高糖PDS刺激H

14、PMCs48h，galectin-1 mRNA及蛋白的表達較正常對照組均顯著上調(P＜0.05)。vimentin mRNA及蛋白表達較正常對照組上調，zo-1 mRNA及蛋白表達較正常對照組下調，均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 (2)galectin-1siRNA轉染入HPMCs后，與高糖刺激組相比較，galectin-1 mRNA及蛋白的表達均被抑制(P＜0.05)，同時vimentin mRNA及蛋白表達明顯下調，