MAPK信號(hào)通路在高糖導(dǎo)致人腹膜間皮細(xì)胞PARP-1激活、細(xì)胞外基質(zhì)聚集及轉(zhuǎn)分化的作用.pdf

1、隨著終末期腎病患病人數(shù)的增加，腎臟替代治療成為腎專(zhuān)科醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注焦點(diǎn)之一。腹膜透析作為腎臟替代治療的一種，具有以下優(yōu)點(diǎn)：不需要血管通路、不影響日常工作和學(xué)習(xí)、能較好的清除中分子物質(zhì)、能延緩殘余腎功能下降的速度等。然而，長(zhǎng)期使用含葡萄糖的透析液會(huì)導(dǎo)致腹膜纖維化，最終放棄腹膜透析。作為長(zhǎng)期腹膜透析患者的常見(jiàn)并發(fā)癥，腹膜纖維化不僅損害腹膜結(jié)構(gòu)，也可導(dǎo)致許多并發(fā)癥，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。然而，目前腹膜纖維化的發(fā)生的具體機(jī)制仍不清楚，而且防治的措

2、施也較為限，因此，探討其發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)因素，具有重要的意義。
　　 正常情況下，腹膜是一連續(xù)的半透膜，由三層結(jié)構(gòu)構(gòu)成：一層由扁平狀問(wèn)皮細(xì)胞呈連續(xù)排列所構(gòu)成的一道單層結(jié)構(gòu)；另一層為問(wèn)皮細(xì)胞(mesothelial cellMCs)下結(jié)締組織；兩者之間又有一層基底膜將兩層分隔。腹膜纖維化發(fā)生時(shí)，首先受累的是腹膜間皮細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞間隙擴(kuò)大，微絨毛減少或消失，細(xì)胞膜葡萄糖載體增多；成纖維細(xì)胞數(shù)量增加出現(xiàn)問(wèn)皮細(xì)胞層下纖維化。其次是血管

3、的變化，表現(xiàn)為毛細(xì)血管數(shù)量增多，且血管基膜增厚。長(zhǎng)期腹膜透析的患者，間皮細(xì)胞的微絨毛減少、消失，從基底膜脫落至完全消失，最后只剩下裸露的纖維結(jié)締組織。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，高糖腹膜透析液可導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞肥大。近期研究還發(fā)現(xiàn)間皮細(xì)胞的肥大是細(xì)胞早期衰老的表現(xiàn)，這可能與腹膜的損傷有關(guān)。最終使腹膜對(duì)感染和纖維化的防御功能受損，導(dǎo)致纖維化和功能進(jìn)行性喪失。
　　 研究顯示：高糖引起活性氧化產(chǎn)物(reactive oxygen sp

4、ecies，ROS)可能在腹膜纖維化中起重要的作用。我們既往的研究表明，在人腹膜間皮細(xì)胞(humanperitoneal mesothelial cells,HPMCs)高血糖介導(dǎo)的ROS可以使多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]活性增加。研究顯示，高糖誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞PARP-1表達(dá)增加；下調(diào)PARP-1的表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的腹膜問(wèn)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)積聚。而絲裂素原活化蛋白激

5、酶通路可被活性氧化產(chǎn)物而激活。ROS可激活MAPK，又可活化PARP-1。研究表明，PARP-1的活化可以通過(guò)細(xì)胞DNA損傷或非DNA損傷而介導(dǎo)，并呈細(xì)胞損傷程度和時(shí)間依賴(lài)性。在細(xì)胞損傷早期，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，PARP-1表達(dá)上調(diào)；后期，大量ROS損傷DNA，活化PARP-1，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞修復(fù)損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。活化PARP-1的依賴(lài)DNA損傷與非依賴(lài)DNA兩種平行方式時(shí)有重疊，這對(duì)在細(xì)胞生理、病理狀態(tài)下PARP-1的功能調(diào)節(jié)有

6、重要意義。有研究認(rèn)為，在細(xì)胞受損早期，細(xì)胞外信號(hào)可通過(guò)MAPK信號(hào)通路激活PARP-1，參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)；大量ROS可通過(guò)MAPK通路介導(dǎo)PARP-1活化，參與細(xì)胞凋亡等。
　　 目前，在高糖刺激下，MAPK信號(hào)通路是否參與HPMCs的PARP-1的激活，目前尚不清楚。本研究就以上問(wèn)題試圖初步探討MAPK信號(hào)通路和PARP-1的關(guān)系及其激活在腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腹膜纖維化當(dāng)中的作用。這將為腹膜纖維化的防治開(kāi)拓新的視野和途徑

7、，同時(shí)為新藥的開(kāi)發(fā)和研制奠定基礎(chǔ)。
　　 第一章高糖對(duì)HPMCs的MAPK通路及PARP-1的影響
　　 一、目的
　　 探討人腹膜間皮細(xì)胞株HMrSV5在高糖刺激下，三條主要MAPK信號(hào)通路的活化情況及PARP-1的蛋白表達(dá)情況。
　　 二、材料和方法
　　 無(wú)血清培養(yǎng)HMrSV5細(xì)胞株16h～24h后，分別用高糖(終濃度138mmol/L葡萄糖)刺激0'、5'、30'、1h、2h、8h、24h

8、，并選擇等滲的甘露醇作為對(duì)照用。Western Blot分別檢測(cè)不同時(shí)間總的P38MAPK及磷酸化的P38MAPK、總的ERK1/2及磷酸化的ERK1/2、總的JNK及磷酸化的JNK的蛋白表達(dá)水平。同時(shí)用Western blot檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)PARP-1的蛋白表達(dá)情況。
　　 三、小結(jié)
　　 高糖以時(shí)間依賴(lài)的方式刺激HPMCs后，磷酸化的P38MAPK及磷酸化的JNK表達(dá)增加，磷酸化的ERK1/2增高不明顯。同時(shí)PAR

9、P-1的表達(dá)在高糖刺激下也呈時(shí)間依賴(lài)性增高，24小時(shí)已很明顯。因此我們選擇P38MAPK信號(hào)通路的特異抑制劑及JNK信號(hào)通路特異抑制劑分別抑制P38MAPK及JNKMAPK，觀(guān)察抑制其通路后，PARP-1的活性變化及對(duì)腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及對(duì)HPMCs轉(zhuǎn)分化的作用。
　　 第二章 MAPK抑制劑對(duì)PARP-1、腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 第一節(jié) P38抑制劑對(duì)PARP-1的作用、人腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)

10、聚集及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 一、目的
　　 探討 P38抑制劑對(duì)腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用；抑制P38MAPK信號(hào)通路后，PARP-1的活性變化。
　　 二、材料和方法
　　 無(wú)血清培養(yǎng)HPMCs16h-24h后，分為4各組：①低糖組(5.6mmol/L葡萄糖)；②刺激組(138mmol/L葡萄糖)；③抑制劑組(138mmol/L葡萄糖+SB203580，10umol/L)④DMSO對(duì)照組

11、。在24小時(shí)收取細(xì)胞用Western blot檢測(cè)PARP-1、FN、PAI-1、E-cadherin及α-SMA的蛋白水平變化。
　　 三、小結(jié)
　　 高糖可刺激腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，P38抑制劑可逆轉(zhuǎn)。P38抑制劑也可下調(diào)其PARP-1的表達(dá)，提示P38MAPK可能能激活PARP-1的表達(dá)，并參與腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程。
　　 第二節(jié) JNK抑制劑對(duì)PARP-1

12、的、人腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用
　　 一、目的
　　 探討 JNK抑制劑對(duì)腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用；抑制JNK信號(hào)通路后，PARP-1的活性變化。
　　 二、材料和方法
　　 無(wú)血清培養(yǎng)人腹膜間皮細(xì)胞株16h-24h后，分為4各組：①低糖組(5.6mmol/L葡萄糖)；②刺激組(138mmol/L葡萄糖)；③抑制劑組(138mmol/L葡萄糖+SP600125，10umol

13、/L)④DMSO對(duì)照組。在24小時(shí)收取細(xì)胞用Westem blot檢測(cè)PARP-1、FN、PAI-1、E-cadherin及α-SMA的蛋白水平變化。
　　 三、小結(jié)
　　 高糖可刺激腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，JNK抑制劑可逆轉(zhuǎn)，這提示JNK-PARP-1通路也參與腹膜間皮細(xì)胞外基質(zhì)聚集及人腹間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過(guò)程。
　　 全文總結(jié):高糖可使得人腹膜間皮細(xì)胞P38MAPK及JNKMAPK通路的活化