microRNA-129-5p在人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　 腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是終末期腎臟疾病(end stage renal disease,ESRD)患者最主要的替代治療之一，但是長期腹膜透析引起腹膜組織纖維化(peritoneal fibrosis,PF)而導(dǎo)致超濾衰竭(ultrafiltration failure,UFF)，限制了腹膜透析的應(yīng)用。腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transi

2、tion,EMT)是腹膜纖維化的起始和可逆環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)沉積是腹膜纖維化的主要組織學(xué)改變。研究表明轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在腹膜透析病人腹膜EMT及ECM沉積的過程中起到了關(guān)鍵的作用，并受到多個(gè)因素的調(diào)控。
　　 microRNA是存在于動(dòng)植物基因組中的功能性非編碼小RNA，大多為21～25個(gè)核苷酸，可與靶mRN

3、A3’端非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。microRNA廣泛參與到生長發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生等過程中，且與許多疾病，包括EMT相關(guān)。研究顯示部分microRNA在TGF-β誘導(dǎo)的EMT中調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄抑制因子如Smad作用蛋白-1(Smad interacting protein1,SIP1)，或TGF-β的下游結(jié)締組織生長因子(connective ti

4、ssue growth factor，CTGF)等的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)EMT的調(diào)節(jié)作用。基于以上分析，我們認(rèn)為，特定的microRNA參與了調(diào)控腹膜間皮細(xì)胞EMT及纖維化。為此，本研究開展如下：
　　 第一章腹膜透析患者腹膜透析流出液間皮細(xì)胞中microRNA的異常表達(dá)及其與轉(zhuǎn)分化的關(guān)系
　　 目的：檢測(cè)腹膜透析患者腹膜透析流出液細(xì)胞中microRNA的表達(dá)及EMT發(fā)生情況，初步探討microRNA-129-5p與腹膜間皮

5、細(xì)胞EMT的關(guān)系。
　　 方法：隨機(jī)選取新開管持續(xù)不臥床腹膜透析( continuous ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)患者10人，腹透半年以上者12人，分離培養(yǎng)并鑒定流出液細(xì)胞；通過micro array得出二者microRNA差異表達(dá)譜并用realtime PCR Taqman探針法驗(yàn)證microRNA-129-5p的表達(dá)；采取realtime PCR、western blot觀察流

6、出液細(xì)胞中E-cadherin、claudinl、vimentin、FN的表達(dá)。
　　 結(jié)果：腹透流出液細(xì)胞為腹膜間皮細(xì)胞，不同透齡患者流出液細(xì)胞存在形態(tài)學(xué)改變。透析半年以上組較新開管組33個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)，58個(gè)下調(diào)，其中microRNA-129-5p在半年以上組中明顯下調(diào)。半年以上組流出液細(xì)胞E-鈣黏素(E-cadherin)、claudin1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于新開管組，而波形蛋白(vimentin)及纖

7、維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于新開管組。
　　 結(jié)論：腹膜透析患者腹透流出液細(xì)胞經(jīng)證實(shí)為HPMC，并表達(dá)多個(gè)EMT相關(guān)的microRNA；隨腹透時(shí)間延長，microRNA-129-5p表達(dá)顯著降低同時(shí)伴有EMT及ECM沉積，提示microRNA-129-5p可能與腹膜纖維化有關(guān)。
　　 第二章 microRNA-129-5p在人腹膜間皮細(xì)胞株中的表達(dá)及其對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)分化的影

8、響
　　 目的：闡明microRNA-129-5p在TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞EMT及ECM沉積中的作用，以尋找逆轉(zhuǎn)腹膜間皮細(xì)胞纖維化的方法。
　　 方法：用5ng/ml TGF-β1刺激HMrSV5細(xì)胞，通過realtime PCR及western blot檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、claudinl、vimentin、FN及microRNA-129-5p的表達(dá)：轉(zhuǎn)染microRNA-129-5p的前體(p

9、re-mir-129-5p)及陰性對(duì)照pre-miR negative control，再予TGF-β1刺激，通過細(xì)胞免疫熒光、realtime PCR及western blot檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞E-cadherin、claudinl、vimentin、FN的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：5ng/ml TGF-β1刺激后，HMrSV5細(xì)胞E-cadherin、claudinl mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性降低，vimentin

10、、FN mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性升高，microRNA-129-5p呈時(shí)間依賴性降低。與TGF-β1刺激組比較，過表達(dá)microRNA-129-5p使E-cadherin、claudinl上調(diào)，vimentin、FN下調(diào)；但轉(zhuǎn)染pre-miR negative control對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞E-cadherin、claudinl、vimentin、FN的表達(dá)變化無明顯影響。
　　 結(jié)論： TGF-β

11、1誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞EMT及ECM沉積；TGF-β1誘導(dǎo)microRNA-129-5p表達(dá)下調(diào)；上調(diào)microRNA-129-5p可逆轉(zhuǎn)HMrSV5細(xì)胞EMT，抑制ECM沉積。
　　 第三章 microRNA-129-5p通過調(diào)節(jié)SIP1參與TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化
　　 目的闡明microRNA-129-5p參與調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞EMT和ECM沉積的可能機(jī)制，為靶向microRNA-

12、129-5p防治腹膜纖維化提供理論依據(jù)。
　　 方法用5ng/ml TGF-β1刺激HMrSV5細(xì)胞，通過realtime PCR及western blot檢測(cè)細(xì)胞中SIP1的表達(dá)；轉(zhuǎn)染pre-mir-129-5p及陰性對(duì)照pre-miR negative control，再予TGF-β1刺激，通過細(xì)胞免疫熒光、realtime PCR及western blot檢測(cè)HMrSV5細(xì)胞SIP1的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果5ng/

13、ml TGF-β1刺激后，HMrSV5細(xì)胞SIP1 mRNA及蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性上調(diào)。與TGF-β1刺激組比較，過表達(dá)microRNA-129-5p使SIP1蛋白水平下調(diào)，而mRNA水平無變化；轉(zhuǎn)染pre-miR negative control對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HMrSV5細(xì)胞SIP1的表達(dá)變化無明顯影響。
　　 結(jié)論 TGF-β1誘導(dǎo)HMrSV5細(xì)胞SIP1表達(dá)上調(diào)；miRNA-129-5p通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)SIP1