過(guò)表達(dá)E-鈣粘蛋白對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、目的：E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-ECAD)轉(zhuǎn)染人腹膜間皮細(xì)胞永生化細(xì)胞株（HMrSV5），觀察E-cad的過(guò)表達(dá)對(duì)腹膜間皮細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)的影響。
　　方法：⑴采用大腸桿菌DH5α進(jìn)行pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒及空白質(zhì)粒(Vector)擴(kuò)增，酶切鑒定，RT-PCR驗(yàn)證。⑵體外培養(yǎng)HMr

2、SV5，將HMrSV5分為正常對(duì)照組、E-cad轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(lip LTX)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒及空質(zhì)粒，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)染效率，采用RT-PCR、Western Blot分別觀察轉(zhuǎn)染后12h、24h、36h、48h、72h E-cad的mRNA及蛋白表達(dá)。⑶將HMrSV5分為正常對(duì)照組、TGF-β刺激組，采用WesternBlot、細(xì)胞免疫熒光觀察TGF

3、-β刺激后12h、24h、36h、48h E-cad、α-SMA的蛋白表達(dá);驗(yàn)證TGF-β刺激對(duì)HMrSV5EMT的影響。⑷將HMrSV5分為正常對(duì)照組、TGF-β刺激組、pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+TGF-β刺激組，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(lip LTX)轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒，并分別給予TGF-β刺激，采用RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染+刺激（或單純刺激）后12h、24h、36h、48h E-cadmRNA的表達(dá)，采

4、用Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染+刺激及單純刺激后12h、24h、36h、48hα-SMA、Vimentin的蛋白表達(dá);采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染+刺激（或單純刺激）后12h、24h、36h、48h E-cad、α-SMA的蛋白表達(dá)，觀察E-cad的過(guò)表達(dá)對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的HMrSV5EMT的影響。
　　結(jié)果：①擴(kuò)增質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切電泳鑒定，RT-PCR證實(shí)，擴(kuò)增質(zhì)粒序列無(wú)突變。②pIRES2-EGFP-ECAD質(zhì)粒

5、轉(zhuǎn)染HMrSV512h細(xì)胞內(nèi)E-cadmRNA表達(dá)量最高，隨后逐步下降，與正常對(duì)照組比較有差異(p＜0.05)，轉(zhuǎn)染后12h細(xì)胞內(nèi)E-cad表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，36小時(shí)達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，與正常對(duì)照組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較均有顯著差異(p＜0.01)。③TGF-β刺激HMrSV5后，細(xì)胞內(nèi)α-SMA表達(dá)逐步上調(diào)，呈時(shí)間依賴性趨勢(shì)，與正常對(duì)照組相比有顯著差異(p＜0.01)。④轉(zhuǎn)染后+刺激組與單純刺激組比較，細(xì)胞內(nèi)α-SMA、Vimentin表