過(guò)表達(dá)E-鈣黏蛋白對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響.pdf

1、目的:E-鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad) cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，觀察E-cad的過(guò)表達(dá)對(duì)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。
　　 方法:(1)采用大腸桿菌DH5α進(jìn)行E-cad cDNA質(zhì)粒及空白質(zhì)粒擴(kuò)增，酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證。(2)體外培養(yǎng)HK-2，將HK-2分為正常對(duì)照組、高糖組(30mmo

2、l/l)、甘露醇組（30mmo/l），倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;采用Real time PCR、Western Blot分別觀察0h、24h、48h、72h E-cad和α-SMA的RNA及蛋白表達(dá);采用ElISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液上清中COLⅠ、COLⅢ和FN的濃度變化，觀察高糖對(duì)HK-2 EMT及細(xì)胞外基質(zhì)的影響。(3)將HK-2分為正常對(duì)照組、空質(zhì)粒組、E質(zhì)粒組，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染E-cad質(zhì)粒，采用Real timePC

3、R和Western Blot方法分別檢測(cè)0h、24h、48h、72h E-cad的表達(dá)水平。(4)將HK-2分為正常對(duì)照組、高糖組、E質(zhì)粒組、E質(zhì)粒+高糖組、空白質(zhì)粒+高糖組。觀察48h E-cad過(guò)表達(dá)對(duì)HK-2 EMT的影響，采用Real time PCR、Western Blot分別觀察高糖刺激后48h E-cad和α-SMA的mRNA及蛋白表達(dá);采用ElISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和FN的濃度變化。
　　

4、 結(jié)果:(1)擴(kuò)增質(zhì)粒經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶電泳鑒定，測(cè)序分析證實(shí)，擴(kuò)增質(zhì)粒序列無(wú)突變。(2)高糖作用后可見(jiàn)HK-2由橢圓形貼壁生長(zhǎng)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，以48h、72h尤為明顯;E-cad表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)上調(diào)，與正常對(duì)照組與甘露醇組相比均有顯著性差異;ELISA結(jié)果顯示，高糖刺激后COLⅠ、COLⅢ和FN表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)，其中48h、72h與正常對(duì)照組與甘露醇組相比有顯著性差異。(3)經(jīng)E-cad質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下可見(jiàn)GEFP表達(dá);R

5、eal time PCR和Western blot結(jié)果表明，E-cad mRNA及蛋白表達(dá)均上調(diào)，其中轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h與正常對(duì)照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，有顯著性差異。(4)高糖作用48h后，顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)E-cad轉(zhuǎn)染組細(xì)胞變形較高糖組減輕。Real time PCR和Western Blot結(jié)果顯示，較高糖組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);ELISA表明，過(guò)表達(dá)E-cad能明顯抑制高糖誘導(dǎo)