MicroRNA-346在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、研究背景:
　　糖尿病腎病（diabeticnephropathy,DN）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢，由此而導(dǎo)致的終末期腎臟病(end-stagerenaldisease，ESRD)的發(fā)病率也越來越高。DN發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，涉及體內(nèi)多種蛋白、多條細(xì)胞信號通路的改變。DN的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿、繼發(fā)腎小球硬化、腎臟纖維化。足細(xì)胞作為一種高度分化的細(xì)胞，在維持腎小球濾過膜的完整性方面具有重要的生理意義

2、。大量研究表明:足細(xì)胞受損是腎小球損傷的中心環(huán)節(jié)，多種理化、生物因素均可影響足細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生。
　　microRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性、非編碼小RNA，與其靶基因3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的堿基互補(bǔ)配對，從而在轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致mRNA的降解或抑制，發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。miRNA在生物的發(fā)育分化，細(xì)胞增殖、凋亡，及器官形成及疾病發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。近年的研究表明miRNA可能參與了DN的發(fā)生發(fā)

3、展，但其具體機(jī)制不詳，需要進(jìn)一步深入研究。近年來有少數(shù)研究表明miR-346可以通過調(diào)節(jié)GSK-3β并激活Wnt/β-Catenin通路調(diào)節(jié)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，然而在高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中miR-346的表達(dá)及其功能目前仍不明確。GSK-3β是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化三條通路中一個重要的調(diào)控因子，在通路中起著承上啟下的作用，我們前期的研究已經(jīng)表明，GSK-3β參與了高糖環(huán)境下足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，miR-346能否通過調(diào)節(jié)GSK

4、-3β從而影響高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，有待于進(jìn)一步的研究。
　　目的:
　　本研究通過檢測不同糖濃度環(huán)境中小鼠足細(xì)胞miR-346表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染miR-346mimic和miR-346inhibitor對足細(xì)胞表型的影響，旨在探討miR-346是否參與了高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，并驗證這種作用是否通過GSK-3β介導(dǎo)，從而初步探討miR-346在DN早期發(fā)生、發(fā)展中所起的作用，為DN發(fā)生機(jī)制及治療措施的研究提供一定的理論依據(jù)。

5、
　　方法:
　　1.不同濃度的葡萄糖中足細(xì)胞miR-346的表達(dá)變化，以不同濃度葡萄糖(12.5mmol/L，25mmol/L)培養(yǎng)足細(xì)胞36h，并含正常對照組(5.6mmol/L葡萄糖)和高滲對照組（5.6mmol/L葡萄糖+44.4mmol/L甘露醇），應(yīng)用RT-PCR檢測足細(xì)胞miR-346表達(dá)。
　　2.利用miR-346mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染高糖（25mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)足細(xì)胞，并設(shè)高糖對照

6、組（25mmol/L葡萄糖）。應(yīng)用Western-blot檢測足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin，間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白α-SMA。
　　3.構(gòu)建GSK-3βmRNA3'-UTR及miR-346熒光素酶報告質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，雙熒光素酶活性檢測驗證GSK-3βmRNA的3'-UTR與miR-346有無直接結(jié)合。
　　4.利用miR-346mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染（5.6mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)足細(xì)胞，應(yīng)用Wes

7、tern-blot檢測足細(xì)胞內(nèi)GSK-3β在蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.miR-346在高糖刺激的足細(xì)胞中的表達(dá)
　　與正常糖(5.6mmol/L)對照組比較，12.5mmol/L高糖組中，足細(xì)胞中miR-346的表達(dá)顯著升高(P＜0.05);隨著糖濃度的增加，miR-346表達(dá)量降低，25mmol/L高糖組miR-346表達(dá)量與12.5mmol/L高糖比較，miR-346的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，但與

8、正常對照組比較表達(dá)量無明顯改變(P＞0.05)。
　　2.miR-346mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后nephrin，α-SMA
　　與高糖(25mmol/L)組比較，轉(zhuǎn)染miR-346mimic后，足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin表達(dá)明顯升高，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白α-SMA表達(dá)降低(P＜0.05);而轉(zhuǎn)染miR-346inhibitor后，與高糖組比，足細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白nephrin表達(dá)降低，間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白α

9、-SMA表達(dá)升高(P＜0.05)。
　　3.雙熒光素酶報告驗證miR-346對GSK-3β有無調(diào)控作用
　　成功構(gòu)建GSK-3βmRNA的3'-UTR及miR-346的熒光素酶報告質(zhì)粒，并以轉(zhuǎn)染miR-346及野生型GSK-3β質(zhì)粒的293T細(xì)胞為實(shí)驗組，內(nèi)參為海腎熒光素酶活性，相對熒光素酶活性為螢火蟲熒光活性和海腎熒光活性的比值，轉(zhuǎn)染miR-346質(zhì)粒的細(xì)胞與重組載體的細(xì)胞熒光素酶活性與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.

10、05）。
　　4.miR-346mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染正常糖足細(xì)胞后GSK-3β的變化
　　與正常糖(5.6mmol/L)組比較，轉(zhuǎn)染miR-346mimic后，GSK-3β的蛋白表達(dá)降低(P＜0.05);轉(zhuǎn)染miR-346inhibitor后，與正常糖組比較，GSK-3β的蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.體外培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞中高糖影響miR-346表達(dá)，初步證明了miR-346可能參與了D