PRS-CTGF-siRNA抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞CTGF、VEGF及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響.pdf

1、腹膜透析是終末期慢性腎功能衰竭的主要替代治療方法之一。腹膜纖維化導(dǎo)致的透析效能減退是慢性腹透病人退出的主要原因。腹膜纖維化的發(fā)生主要與非生理性的腹膜透析液及代謝產(chǎn)物、反復(fù)發(fā)作的腹膜炎、細(xì)胞因子等有關(guān)。 大量研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在腹膜纖維化的發(fā)生中起中樞作用。但TGF-β1為一多功能細(xì)胞因子，效應(yīng)復(fù)雜，完全將其阻斷后果難以預(yù)料。結(jié)締組織生長因子(CTGF)是介導(dǎo)TGF-β 1促纖維化作用的一個(gè)重要下游因子。

2、可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的生成。由于CTGF主要介導(dǎo)TGF-β1的負(fù)面效應(yīng)，其作用單一，直接抑制CTGF的表達(dá)可以避免在上游阻斷TGF-β1帶來的副作用。因此CTGF可以作為抗腹膜纖維化治療的新靶點(diǎn)。而RNA干擾技術(shù)(RNAi)是基因功能研究中具有廣闊應(yīng)用前景的方法，尤其適合抑制細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因的表達(dá)。為此，選擇RNAi技術(shù)作為研究方法之一。 病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi轉(zhuǎn)移方法具有轉(zhuǎn)移效率高、長效、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。pRS載體是由

3、無自身免疫活性的鼠源性干細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒(pMSCV)，轉(zhuǎn)運(yùn)含抗嘌呤霉素的pSUPER質(zhì)粒載體構(gòu)建成pRETRO-SUPER(pRS)結(jié)構(gòu)。其介導(dǎo)的RNAi技術(shù)具有特異性強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率高、對細(xì)胞毒性小和作用時(shí)間持久等優(yōu)點(diǎn)。在研究中構(gòu)建了PRS載體介導(dǎo)的CTGF小分子干擾RNA(siRNA)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，即PRS-CTGF-siRNA載體。并用此載體轉(zhuǎn)染PT-67包裝細(xì)胞株，進(jìn)而感染人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)，研究其對于HPMCs的CT

4、GF、VEGF及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。 目的：利用：PRS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的表達(dá)人CTGF基因小干擾。RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PRS-CTGF-siRNA)轉(zhuǎn)染PT-67包裝細(xì)胞株，進(jìn)而感染人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)，研究其對于HPMCs的CTGF、VEGF及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。 方法：用生物信息學(xué)方法找到人CTGF基因最完整的編碼序列，按照siRNA序列設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)4對siRNA靶序列。并根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PR

5、S的特點(diǎn)設(shè)計(jì)各位點(diǎn)的前體64bpDNA序列，并在體外合成。將體外合成的各位點(diǎn)的64bp正義和反義兩條鏈退火。PRS載體用BglII、HindⅢ雙酶切完全后與退火產(chǎn)物進(jìn)行膠連，16℃連接過夜。連接后去載體自連。將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)行酶切鑒定、測序。測序正確的克隆進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，用Tipl00抽提質(zhì)粒，供轉(zhuǎn)染使用。將：PRS-CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h后更換完全培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48h后

6、按1：10傳代，加入含2.5μg／ml嘌呤霉素(puromycin)篩選14d，直至抗性細(xì)胞集落形成。挑選大的健康的細(xì)胞集落，用完全培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，以制備含病毒的包裝細(xì)胞上清，利用NIH3T3細(xì)胞測定病毒滴度。獲得含CTGF-siRNA基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液，并根據(jù)病毒滴度結(jié)果選擇高滴度病毒上清液稀釋后感染HPMCs(加入終濃度4-8ug／ml的多聚季胺)。為了增強(qiáng)感染效率,每隔12小時(shí)連續(xù)感染靶細(xì)胞。感染24小時(shí)后,用含0.5ug/m

7、l的puromycin培養(yǎng)基加壓篩選,每2天換一次培養(yǎng)液直至對照組細(xì)胞全被殺死。繼續(xù)抗性篩選10～14天,直至克隆形成。挑選健康、大克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行檢測。使用TGF-β1刺激,觀察PRS-CTGF-siRNA對TGF-β1刺激下HPMCs的CTGF、VEGF及細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。CTGF、VEGF、FN、ColI、laminin mRNA表達(dá)采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)半定量分析。采用Westem-blot方法檢測HPMC

8、s中CTGF、VEGF、FN、ColI、laminin蛋白質(zhì)水平。 結(jié)論:體外培養(yǎng)的HPMC可以少量表達(dá)CTGF、VEGF及FN、ColI、LN;TGF-β1可明顯增加HPMCs細(xì)胞內(nèi)CTGF、VEGF和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá);PRS-CTGF-siRNA可明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HPMCs細(xì)胞內(nèi)CTGF、VEGF及細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)。提示PRS-CTGF-siRNA對于腹膜纖維化可能具有潛在治療價(jià)值。并為腹膜纖維化的