siRNA阻斷Smad3表達(dá)對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞增殖、分泌細(xì)胞外基質(zhì)及基質(zhì)金屬蛋白酶影響.pdf

1、目的通過觀察Smad3基因的RNA干擾(RNAi)對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的小鼠肌成纖維細(xì)胞(C2C12)的增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)及基質(zhì)金屬蛋白酶的影響，探討RNAi技術(shù)在阻斷TGF-β1-Smad3信號(hào)通路中的應(yīng)用和TGF-β1-Smad3在肌成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)及其基質(zhì)金屬蛋白酶中的作用，進(jìn)一步探討器官纖維化的發(fā)病機(jī)理，為設(shè)計(jì)siRNA藥物和治療纖維化疾病提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)資料。 方法用不同濃度(0、1

2、、5、10ng/ml)TGF-β1干預(yù)C2C12細(xì)胞24h，觀察其增殖和分泌Ⅰ型膠原(collagentype1)、膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)的改變。利用體外轉(zhuǎn)錄合成的Smad3基因短干擾RNA(siRNA-Smad3)，經(jīng)脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24h，以阻斷Smad3基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(siRNA-Smad3+5ng/mlTGF-β1)、內(nèi)對(duì)照組(siRNA-control+5ng

3、/mlTGF-β1)和空白對(duì)照組(siRNA-control+0ng/mlTGF-β1)。用Westernblot檢測(cè)Smad3和磷酸化的Smad3(P-Smad3)；用MTT法和3H-Thymidine法觀察C2C12細(xì)胞增殖；用ELISA法檢測(cè)Ⅰ型膠原的分泌，用RT-PCR法檢測(cè)其基因表達(dá)；用Westernblot檢測(cè)MT1-MMP的表達(dá)，用Northernblot檢測(cè)其基因表達(dá)；用ELISA法檢測(cè)MMP-2的分泌和激活。

4、結(jié)果(1)5ng/mlTGF-β1干預(yù)C2C12細(xì)胞0、0.5、1、2、5、6小時(shí)，促進(jìn)Smad3磷酸化。0.5小時(shí)開始誘導(dǎo)Smad3磷酸化，5小時(shí)高峰(6孔培養(yǎng)板)。(2)0、1、5、10ng/mlTGF-β1干預(yù)C2C12細(xì)胞5小時(shí)，誘導(dǎo)Smad3磷酸化呈劑量依賴性。(3)50、100、200pmol/LsiRNA-Smad3+Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24小時(shí)，Smad3表達(dá)逐漸被抑制到無表達(dá)。200pm

5、ol/LsiRNA-control與controlSmad3表達(dá)基本一致，無改變。(4)200pmol/LsiRNA-Smad3+Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，加5ng/mlTGF-β1干預(yù)5小時(shí)，Smad3無表達(dá)。20pmol/LsiRNA-control轉(zhuǎn)染組Smad3表達(dá)無影響，Smad3磷酸化存在。(5)0、1、5、10ng/mlTGF-β1干預(yù)C2C12細(xì)胞24小時(shí)，促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖，其

6、MTT(OD值)分別是0.096±0.015，0.177±0.014，0.240±0.028，0.312±0.012，[3H](cpm/min)值分別是630±17，907±19，1493±25，1808±24。(6)200pmol/LsiRNA-Smad3、200pmol/LsiRNA-control轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，用0，5ng/mlTGF-β1分別干預(yù)24小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組增殖無改變；而對(duì)照組細(xì)胞增殖增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組MTT值和[

7、3H]值分別為0.063±0.011、428±38，內(nèi)對(duì)照組分別為0.137±0.016、1062±50，空白對(duì)照組分別為0.066±0.006、464±30。實(shí)驗(yàn)組和內(nèi)對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。(7)0、1、5、10ng/mlTGF-β1分別干預(yù)C2C12細(xì)胞24小時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原分泌。其ELISA法(CICP，ng/ml)檢測(cè)結(jié)果分別為616±16，713±

8、19，783±23，853±17，RT-PCR法(Ⅰ型膠原/β-actin光密度比值)分別為0.93±0.08，1.83±0.17，2.50±0.29，2.94±0.14。(8)200pmol/LsiRNA-Smad3、200pmol/LsiRNA-control轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，用0、5ng/mlTGF-β1分別干預(yù)24小時(shí)后，ELISA法檢測(cè)Ⅰ型膠原，實(shí)驗(yàn)組無改變(413±20ng/ml)，空白對(duì)照組無改變(473±29

9、ng/ml)，而內(nèi)對(duì)照組分泌增強(qiáng)(571±29ng/ml)。用RT-PCR(半定量)檢測(cè)其基因表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組無改變(0.78±0.17)，空白對(duì)照組無改變(0.86±0.10)，而內(nèi)對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)(1.85±0.19)。實(shí)驗(yàn)組和內(nèi)對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。(9)C2C12細(xì)胞表達(dá)MT1-MMP,MMP-2(Westernblot)，0、1、5、10ng/miTGF-β1分別

10、干預(yù)C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，抑制MT1-MMP分泌和基因表達(dá)(Westernblot、Northernblot)。200pmol/LsiRNA-Smad3、siRNA-control轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，用0.5ng/mlTGF-β1干預(yù)24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組有MT1-MMP基因表達(dá)，而對(duì)照組無表達(dá)。(10)0、1、5、10ng/mlTGF-β1分別干預(yù)C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，活性型MMP-2(ELISA)(ng/ml)值分別為

11、23.09±4.37、14.42±2.30，9.50±1.18，and4.48±0.69ng/ml，而總MMP-2值分別為177±20，180±15，171±18，179±28ng/ml。用5ng/mlTGF-β1干預(yù)C2C12細(xì)胞在不同時(shí)間里，活性型MMP-2(ELISA法)值分別為16.53±2.56ng/ml(4h)、8.00±2.02ng/ml(12h)、9.39±2.60ng/ml(24h)，總MMP-2值分別為157±17n

12、g/ml(4h)、174±16ng/ml(12h)、189±18ng/ml(24h)aTGF-β1抑制MMP-2激活，對(duì)其基因表達(dá)無影響。(11)200pmol/LsiRNA-Smad3、200pmol/LsiRNA-control轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞24小時(shí)后，用0，5ng/mlTGF-β1分別干預(yù)24小時(shí)，活性型MMP-2值(ELISA)為：實(shí)驗(yàn)組20.09±2.27ng/ml，內(nèi)對(duì)照組9.82±2.18ng/ml，空白對(duì)照組20.8

13、0±1.53ng/ml。實(shí)驗(yàn)組和內(nèi)對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論(1)TGF-β1促進(jìn)C2C12細(xì)胞Smad3磷酸化呈劑量與時(shí)間依賴性；siRNA阻斷C2C12細(xì)胞Smad3表達(dá)與Smad3磷酸化。(2)TGF-β1促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖呈劑量依賴性；siRNA阻斷Smad3表達(dá)消除了TGF-β1的促C2C12細(xì)胞增殖作用。(3)TGF-β1促進(jìn)C2C12細(xì)胞Ⅰ

14、型膠原合成與mRNA表達(dá)呈劑量依賴性，siRNA阻斷了Smad3表達(dá)消除了TGF-β1的促進(jìn)Ⅰ型膠原合成與mRNA表達(dá)作用。(4)TGF-β1抑制C2C12細(xì)胞MT1-MMP蛋白和mRNA表達(dá)呈劑量與時(shí)間依賴性；siRNA阻斷Smad3表達(dá)消除了TGF-β1的抑制MT1-MMP蛋白和mRNA表達(dá)作用。(5)TGF-β1抑制C2C12細(xì)胞MMP-2的激活呈劑量與時(shí)間依賴性；siRNA阻斷Smad3表達(dá)消除了TGF-β1的抑制MMP-2激活