RNA干擾沉默CTGF對人成骨樣MG63細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響.pdf

1、第一部分RNA干擾沉默CTGF對人成骨樣MGG63細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響。 目的:我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇可下調(diào)人成骨樣MG63細(xì)胞CTGF的表達(dá)，但人成骨樣MG63細(xì)胞CTGF表達(dá)下調(diào)所引起的生物學(xué)效應(yīng)尚不清楚。本研究用RNA干擾技術(shù)，阻斷CTGF在人成骨樣MG63細(xì)胞中的表達(dá)，觀察CTGF降表達(dá)后對人成骨樣MG63細(xì)胞Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響。并觀

2、察抑制CTGF的內(nèi)源性的表達(dá)對人成骨樣MG63細(xì)胞活力的影響。 方法:針對人CTGF mRNA 440、875、910位點(diǎn)設(shè)計、合成三對21核苷酸siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)；在陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人成骨樣MG63細(xì)胞，以空白及非特異性siRNA作為對照，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。采用Northern雜交觀察CTGF mRNA表達(dá)水平的改變，半定量RT—PCR觀察Ⅰ型膠原、ALP、MMP-1、MMP-2

3、mRNA表達(dá)的改變，western blotting觀察CTGF、MMP-1、MMP-2蛋白表達(dá)的變化。MTT法測定RNA干擾后人成骨樣MG63細(xì)胞活力。 結(jié)果:體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNAl(對應(yīng)于440位點(diǎn))、siRNA3(對應(yīng)于910位點(diǎn))轉(zhuǎn)染人成骨樣MG63細(xì)胞后，能抑制CTGF mRNA和蛋白的表達(dá)，其中siRNAl的抑制作用更為顯著，可將CTGF蛋白抑制達(dá)70％以上，siRNA2(對應(yīng)于875位點(diǎn))對人成骨樣MG63細(xì)胞

4、CTGF的表達(dá)無明顯作用；在siRNA1、siRNA3組，隨CTGF表達(dá)下調(diào)，成骨細(xì)胞的Ⅰ型膠原、ALP mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，而在siRNA2組Ⅰ型膠原、ALP mRNA表達(dá)則無明顯變化；在siRNA1、siRNA3組，隨CTGF表達(dá)下調(diào)，MMP-1mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而MMP-2 mRNA、蛋白表達(dá)均無明顯變化。此外，我們還觀察到，CTGF表達(dá)下調(diào)使siRNA1組和siRNA3組的人成骨樣MG63細(xì)胞存活率顯著降低。

5、 結(jié)論:CTGF表達(dá)下調(diào)可抑制MG63細(xì)胞Ⅰ型膠原、ALP、MMP-1mRNA的表達(dá)，下調(diào)MMP-1蛋白的表達(dá)，降低MG63細(xì)胞活力，但對MMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)無明顯變化。說明CTGF是維持人成骨樣MG63細(xì)胞存活、正常分化所必需的細(xì)胞因子；CTGF可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)在維持骨代謝平衡中發(fā)揮重要的作用。 第二部分重組人結(jié)締組織生長因子對人成骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響。 目的:研究重組人結(jié)締組織生長因

6、子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)對人成骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響。 方法:用rCTGF干預(yù)體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞，采用<'3>H-TdR摻入法檢測人成骨細(xì)胞增殖率，α-磷酸萘酚法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性變化，放免法測定骨鈣素含量的變化，western blotting檢測Ⅰ型膠原表達(dá)的變化，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測rCTGF對成骨細(xì)胞凋亡的影響；采用熒

7、光染料吖啶橙和溴化乙錠染色，激光共聚焦顯微鏡觀察rCTGF對細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果: rCTGF呈劑量依賴性促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖，200ng/mL rCTGF達(dá)最大促增殖效應(yīng)；rCTGF干預(yù)顯著促進(jìn)人成骨細(xì)胞分化，rCTGF呈劑量依賴性增加Ⅰ型膠原、骨鈣素表達(dá)及堿性磷酸酶活性；rCTGF干預(yù)可無血清誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡減少48％，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)'果顯示200ng/mL rCTGF干預(yù)組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少。 結(jié)論:rC

8、TGF可顯著促進(jìn)人成骨細(xì)胞的增殖和分化，并抑制人成骨細(xì)胞凋亡。CTGF通過增加成骨細(xì)胞的數(shù)量、增加骨基質(zhì)的合成，具有刺激骨形成的作用。因為rCTGF僅含成熟CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域，所以CTGF主要通過其C-末端結(jié)合區(qū)發(fā)揮促進(jìn)人成骨細(xì)胞增殖、分化的生物學(xué)效應(yīng)。 第三部分重組人結(jié)締組織生長因子對人成骨細(xì)胞護(hù)骨素/核因子K B受體活化配體表達(dá)的影響。 目的:研究重組人結(jié)締組織生長因子(recombinant human co

9、nnective tissue growth factor rCTGF)對體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞護(hù)骨素/核因子kB受體活化配體表達(dá)的影響，探討結(jié)締組織生長因子調(diào)節(jié)護(hù)骨素/核因子kB受體活化配體表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法:用重組人結(jié)締組織生長因子干預(yù)體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞，采用 western blotting檢測護(hù)骨素/核因子kB受體活化配體蛋白表達(dá)水平的變化，同時觀察重組結(jié)締組織織生長因子對人成骨細(xì)胞焦點(diǎn)黏附酶(focal adh

10、esion kinase FAK)、絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)及AKT磷酸化的影響。 結(jié)果: rCTGF可呈時間一劑量依賴性地抑制人成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)，200ng/ml CTGF作用24～48h達(dá)最大抑制效果，而對人成骨細(xì)胞OPG的表達(dá)無明顯影響。rCTGF可明顯增強(qiáng)p38-MAPK磷酸化，并減少FAK磷酸化，rCTGF干預(yù)對p42/44 MAPK、J

11、NK及AKT磷酸化無明顯影響；p38-MAPK阻斷劑SB 23058可阻斷rCTGF對RANKL表達(dá)的抑制效應(yīng)。 結(jié)論: rCTGF通過增強(qiáng)p38-MAPK磷酸化，減少FAK磷酸化，下調(diào)人成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)。CTGF通過降低人成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)，可抑制破骨細(xì)胞的形成，從而有助于骨代謝平衡的維持。 第四部分重組人結(jié)締組織生長因子對人成骨細(xì)胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響。 目的:研

12、究重組人結(jié)締組織生長因子(recombinant human connective tissue growth factor rCTGF)對體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響，并探討結(jié)締組織生長因子調(diào)節(jié)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法:用重組人結(jié)締組織生長因子干預(yù)體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞，采用 westem blotting檢測膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬

13、蛋白酶-2蛋白表達(dá)水平的變化，同時觀察重組結(jié)締組織織生長因子對人成骨細(xì)胞MAPK及AKT磷酸化的影響。 結(jié)果: rCTGF可呈時間-劑量依賴性地促進(jìn)人成骨細(xì)胞膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)，200ng/mlCTGF作用24～48h達(dá)最大效果。rCTGF可明顯增強(qiáng)p38-MAPK磷酸化，p38-MAPK阻斷劑SB 23058可阻斷rCTGF上調(diào)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1及基質(zhì)金屬蛋白酶一2的效應(yīng)。 結(jié)論: r